《細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)》PPT課件

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1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究中心王婷細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液組織培養(yǎng)：使用組織塊（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)。也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10

2、分鐘-4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1.細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2.細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO

3、3-pH:7.2-7.4滲透壓3.無污染4.無毒實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：儀器：超凈工作臺(tái)壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀離心機(jī)天平水浴箱液氮罐冰箱酸度計(jì)濾器酸缸耗材：培養(yǎng)瓶吸管電動(dòng)吸引器培養(yǎng)板凍存管等超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。濾器CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（75%酒精擦拭)。③箱內(nèi)放置蒸餾水于

4、蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶清洗與消毒清洗玻璃器皿：新：浸泡刷洗浸酸沖洗舊：用后立即浸入水中，及時(shí)沖洗。膠塞：2%NaOH煮沸10-20min沖洗1%稀鹽酸30min沖洗塑料器皿：2%NaOH浸泡過夜沖洗5%稀鹽酸30min沖洗包裝：牛皮紙、棉布、鋁飯盒消毒紫外線消毒:濕熱消毒(高壓蒸汽消毒):濾過消毒:大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采化學(xué)消毒:新潔爾滅、75％酒精細(xì)胞培養(yǎng)用液及配制水：新鮮配置的雙蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH

5、2PO40.20加水至1000ml消化液：1.胰蛋白酶胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制。用濾器過濾除菌。2.EDTA化學(xué)螯合劑對(duì)細(xì)胞有一定離解作用3.膠原酶消化作用溫和，對(duì)細(xì)胞損傷小。培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是

6、根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM、F12等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，

7、但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞．無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充