《菌種選育》PPT課件

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1、7菌種篩選方法所有的微生物育種工作都離不開菌種篩選。尤其是在誘變育種工作中，篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟。經(jīng)誘變處理后，突變細胞只占存活細胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細胞又只是突變細胞中的0.05％～0.2％。微生物的正突變概率極小，產(chǎn)量提高10％以上突變株也只有1/300。微生物的突變類型多，可分為兩大類，第一類為形態(tài)突變株，包括菌落形態(tài)，菌絲形態(tài)，分生孢子形態(tài)。另一類是生化突變株，包括抗性突變型，營養(yǎng)缺陷型，條件致死突變型，產(chǎn)量突變等。因此，要在大量的細胞中尋找真正需要的細胞，就

2、象是大海撈針，工作量很大。簡潔而有效的篩選方法無疑是育種工作成功的關(guān)鍵。在提高篩選品質(zhì)方面，由于過去對菌體生理了解不夠，只能隨機篩選（randomselection），大量篩選無特定標記的突變株，因此篩選效率不佳；其后由菌株的生理研究，以及由實際研發(fā)的經(jīng)驗，發(fā)展出合理定向篩選（rationalselection）技術(shù)。菌種篩選方案在實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，以多為，主使優(yōu)良菌種

3、不致于漏網(wǎng)。復(fù)篩的目的是確認符合生產(chǎn)要求的菌株，以質(zhì)和精為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。篩選方案：第三輪、第四輪…(操作同上)初篩和復(fù)篩工作可以連續(xù)進行多輪，直到獲得較好的菌株為止。采用這種篩選方案，不僅能以較少的工作量獲得良好的效果，而且，還可使某些眼前產(chǎn)量雖不很高，但有發(fā)展前途的優(yōu)良菌株不致于落選。篩選獲得的優(yōu)良菌株還將進一步做工業(yè)生產(chǎn)試驗，考察它們對工藝條件和原料等的適應(yīng)性及遺傳穩(wěn)定性。8抗性篩選抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10–6頻率的突變體存在，就容易篩選出來?？剐酝蛔冎甑?/p>

4、篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。1）一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株?？故删w菌株常用此方法篩選。將對噬菌體敏感的出發(fā)菌株經(jīng)變異處理后的菌懸液大量接入含有噬菌體的培養(yǎng)液中，為了保證敏感菌不能存活，可使噬菌體數(shù)大于菌體細胞數(shù)。此時出發(fā)菌株全部死亡，只有變異產(chǎn)生的抗噬菌體突變株能在這樣的環(huán)境中不被裂解而繼續(xù)生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。耐高溫菌株法篩選：將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時間后再分離。對此溫度敏感

5、的細胞被大量殺死，殘存的細胞則對高溫有較好的耐受性。耐高溫菌株在工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用意義在于它可以節(jié)約冷卻水的用量，尤其是在夏季，并能減少染菌的機會。耐高溫菌株所產(chǎn)生酶的熱穩(wěn)定性較高，適用于一些特殊的工藝過程。耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發(fā)酵能力較高，也適宜提高發(fā)酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。而耐高滲透壓的酵母菌株具有積累甘油的性能，可用于甘油發(fā)酵。耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環(huán)境下一次性篩選獲得。2）階梯性篩選法藥物抗性即抗藥性突變株可在培養(yǎng)基中加入一定量的藥物或

6、對菌體生長有抑制作用的代謝物結(jié)構(gòu)類似物來篩選，大量細胞中少數(shù)抗性菌在這種培養(yǎng)基平板上能長出菌落。但是在相當多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物，這時，藥物抗性突變株的篩選需要應(yīng)用階梯性篩選法。因為藥物抗性常受多位點基因的控制，所以藥物的抗性變異也是逐步發(fā)展的，時間上是漸進的，先是可以抗較低濃度的藥物，而對高濃度藥物敏感，經(jīng)“馴化”或誘變處理后，可能成為抗較高濃度藥物的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴散在培養(yǎng)皿的空間中造成藥物的濃度梯度，可以篩選到耐藥濃度不等的抗性變異菌株，使

7、暫時耐藥性不高，但有發(fā)展前途的菌株不致于被遺漏。階梯性篩選法較適合于藥物抗性菌株的篩選，特別是在暫時無法確定微生物可以接受的藥物濃度情況下。(1)梯度平板法(Gradientplate)先將10ml左右的一般固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，將皿底斜放，使培養(yǎng)基凝結(jié)成斜面，然后將皿底放平，再倒入7-10ml含適當濃度的藥物的培養(yǎng)基，凝固后放置過夜。由于藥物的擴散，上層培養(yǎng)基越薄的部位，其藥物濃度越稀，造成一由稀到濃的藥物濃度漸增的梯度。再將菌液涂布在梯度平板上，藥物低濃度區(qū)域菌落密度大，大都為敏感菌，藥物

8、高濃度區(qū)域菌落稀疏甚至不長，濃度越高的區(qū)域里長出的菌抗性越強。在同一個平板上可以得到耐藥濃度不等的抗性變異菌株。如果菌體對藥物有個耐受臨界濃度，則會形成的明顯界線。梯度平板法也常用于抗代謝拮抗物突變株的篩選，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。異煙肼是吡哆醇的代謝拮抗物，兩者的分子結(jié)構(gòu)類似。根據(jù)微生物產(chǎn)生抗藥性原理，異煙肼抗性突變有可能是產(chǎn)生了分解異煙肼的酶類，也有可能通過合成更高濃度的吡哆醇來克服異煙肼的競爭性抑制。實驗證明多數(shù)菌株是發(fā)生了后一性質(zhì)的變異才獲得抗性的。這樣，通過梯度培養(yǎng)法就可以達到定向培