克隆抗體與抗體工程

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1、單克隆抗體與抗體工程一：細胞融合1：細胞融合技術定義與應用價值細胞融合（cellfusion）又稱體細胞雜交（somatichybridization）或細胞雜交（cellhybridization），是指在離體條件下用人工方法將不同種生物或同種生物不同類型的單細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。利用細胞融合技術使不同的細胞融合成一個新的雜合細胞，這個新的細胞就獲得了兩個親本細胞的遺傳信息和細胞質，從而具備有兩個親本細胞的優(yōu)點。細胞融合技術的應用價值細胞融合能重新組合兩個親本細胞的優(yōu)良遺傳信息，是研究細胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體上定位、改良動物遺傳特性、及創(chuàng)造新的符合人類需要

2、的新的細胞系的極為有效的手段。植物細胞融合與人造小鼠培育過程細胞融合過程——三個階段融合前準備細胞融合及融合后的細胞管理融合前準備主要包括細胞培養(yǎng)材料準備、選擇免疫動物、抗原及免疫方案設計等；細胞融合一個相對簡單的過程，包括骨髓瘤細胞準備、脾細胞分離、融合操作等。用于細胞融合的融合劑可以是病毒、化學試劑，或采用電融合技術進行融合。在最近的二十多年來，細胞融合技術有了長足的發(fā)展，其本身也已成為一們專門的技術在生命科學領域中發(fā)揮巨大作用。融合后的管理對融合細胞進行篩選與克隆、優(yōu)良細胞傳代與保存等；細胞融合的關鍵技術方法1）動物選擇、免疫方案設計、免疫途徑確定2）親本細胞準備、融合技術（條件

3、、物質手段、融合管理）電融合技術細胞克?。河邢尴♂尫ǎ╨imiteddilutiontechnology）和軟瓊脂法（softagarcloningtechnology）3）融合后細胞管理細胞融合技術最有意義的成果之一就是單克隆抗體的制備。單克隆抗體在生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、制藥等眾多領域得到極為廣泛的應用；尤其是人源性單克隆抗體制備技術的發(fā)展，使單克隆抗體具有更高的實用價值。單克隆抗體技術1：抗體的結構與功能抗體的結構抗體的功能——抗原結合活性和特異性（Fab）——激活肌體免疫反應（Fc）激活補體系統(tǒng)介導ADCC、K、NK毒性反應與激活Fc---R結合雜交瘤技術原理與過程雜交瘤技術原理利用

4、兩種細胞突變株，一株為TK-、HGPRT+，另一株為HGPRT-、TK+。在一般培養(yǎng)條件下，細胞可利用主要途徑合成DNA，這些突變細胞能正常生長。當主要途徑被氨基碟呤阻斷時，這兩株細胞不能增殖；如將這兩株細胞融合，則只有異核體雜交瘤細胞能在HAT培養(yǎng)基上存活，因為兩種細胞相互補充了另一種細胞缺失的酶；而未融合的細胞或自身融合的同核體細胞仍然是而TK-或HGPRT-而被淘汰。雜交瘤技術過程單克隆抗體的改造與應用1：單克隆抗體靶向技術與靶向單抗應用單克隆抗體靶向制劑——利用抗體的特異性，將藥物連接到抗體上，在特定的部位發(fā)揮作用的制劑。制備方法：與藥物直接連接McAb小分子藥物大分子藥物應

5、用：——特異性溶解血栓藥物——抗腫瘤藥物——其它藥物2：人源性單抗的制備方法EBV轉化技術EBV轉化---融合技術嵌合抗體技術改型抗體技術噬菌體抗體庫技術EBV轉化技術EBV轉化---融合技術嵌合抗體技術人---鼠嵌合抗體就是用人源性抗體的一部分代替鼠源性抗體的一部分，使之保留對抗原的特異性，又具備與補體和細胞結合的功能，并減少異源性蛋白的抗原性。研究人員設想，用人源性基因代替鼠源性抗體基因中的Fc區(qū)。因為Fc區(qū)的主要功能是激活機體免疫反應，也是產(chǎn)生人抗鼠反應的部分。研究人員利用編碼人抗體Fc區(qū)的DNA片段替換鼠源性的Fc段DNA。嵌合抗體技術嵌合改型抗體鼠源性抗原決定簇鼠源性可變區(qū)人

6、鼠源性抗體高變區(qū)人抗體改型抗體技術嵌合抗體由鼠可變區(qū)與人穩(wěn)定區(qū)組合而成，因而仍有一定的免疫原性。為降低來自小鼠可變區(qū)中骨架區(qū)的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗體中與抗原結合的三個互補決定區(qū)（CDR）基因用以置換人抗體中相應序列。由于這種抗體絕大部分為人源性，只有CDR區(qū)來自小鼠，因而稱為CDR移植抗體（CDRgraftedantibody）。這種抗體在人體內免疫性大為降低改型抗體技術鼠源性基因人源性基因噬菌體抗體庫技術將從人或小鼠B淋巴細胞中分離的mRNA逆轉錄成cDNA，用PCR擴增編碼輕鏈和重鏈的cDNA；然后用限制性內切酶酶解擴增的cDNA片段，克隆到絲狀噬菌體質粒載體中，與

7、絲狀噬菌體蛋白Ⅲ基因連接成融合基因，經(jīng)輔助噬菌體感染大腸桿菌后，攜帶有表達載體的大腸桿菌就會釋放外殼上帶有抗體片段的噬菌體；再用ELISA或免疫親和層析法篩選出特異性抗體。噬菌體抗體庫技術B淋巴細胞分離的mRNA逆轉錄成cDNAPCR擴增編碼輕鏈和重鏈的cDNA限制性內切酶酶解克隆到絲狀噬菌體質粒載體中感染大腸桿菌釋放外殼上帶有抗體片段的噬菌體篩選出特異性抗體3：免疫學研究中應用4：醫(yī)學臨床診斷與治療中的應用5：生物大分子分離純化中的應用細胞融