實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法

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1、生物技術(shù)通訊述實(shí)時(shí)熒光定量的數(shù)據(jù)分析方法〃〃易健明,屈武斌、張成崗軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,全軍軍事認(rèn)知與心理衛(wèi)生研究中心,北京安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院安徽合肥,摘要實(shí)時(shí)熒光定量是目前檢測目的核酸拷貝數(shù)及分析靶基因在表達(dá)水平相對變化的主流技術(shù)。研究表明分析結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于數(shù)據(jù)分析方法的可靠性。我們簡要綜述實(shí)時(shí)熒光定量的數(shù)據(jù)分析方法:,關(guān)鍵詞實(shí)時(shí)熒光定量絕對定量相對定量動(dòng)力學(xué)法;;中圖分類號文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號丨,實(shí)時(shí)熒光定量指數(shù)模型數(shù)據(jù)分析法,是目前檢測核酸含量以及分析基因在表達(dá)水平相對變化的主流技術(shù)“,指數(shù)模塑

2、數(shù)據(jù)分析法的理論基礎(chǔ)認(rèn)為在產(chǎn)具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡便等優(yōu)物擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增期(圖,反應(yīng)體系內(nèi)的引點(diǎn),廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)物和底物過量,聚合酶過量且保持高活性,因域。反應(yīng)的作原理是在反應(yīng)體系此反應(yīng)的擴(kuò)增效率保持最大值不變,擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)加入熒光基團(tuán)(熒光探針或熒光染料),利用熒光的數(shù)量以指數(shù)形式增加,相應(yīng)的指數(shù)函數(shù)表達(dá)式方信號積累實(shí)時(shí)檢測整個(gè)反應(yīng)過程,得到產(chǎn)物擴(kuò)程為足不(£其中足表示第輪循環(huán)反應(yīng)結(jié)增曲線(圖,然后采用合適的數(shù)據(jù)分析方法,計(jì)束后的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量,表示初始模板數(shù)量表示算初始模板數(shù)量絕對定量或初始模板數(shù)

3、量的相對平均擴(kuò)增效率。方程經(jīng)過對數(shù)變換后,得到方程比值相對定量廣。反應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法,按照定量分析的目的,可劃分為絕對定量法和相對:—定量法、按照數(shù)據(jù)分析方法基于的理論基礎(chǔ)和數(shù)學(xué),模型,可劃分為指數(shù)模型數(shù)據(jù)分析法和動(dòng)力學(xué)法。十收稿日期基金項(xiàng)目國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃自:(國家然;科學(xué)基金(,,蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(,挪—,國家科技重點(diǎn)專項(xiàng)(卜】作者簡介:易健明(,男,碩士研究生通信作者:屈武斌,(張成崗,(圖反應(yīng)的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線::焚光閾值閾值循環(huán)數(shù)易健明等:實(shí)時(shí)熒光定量的數(shù)據(jù)分析方法。二。根據(jù)上述理論,指數(shù)模型增效率,衡量標(biāo)準(zhǔn)曲線的

4、質(zhì)量是使數(shù)據(jù)分析法采用的數(shù)據(jù)必須來自指數(shù)擴(kuò)增期,通常用個(gè)以上的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線保證回歸系數(shù)記通過設(shè)置熒光閾值線獲得(圖。大于。絕對定量法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確,是目前熒光閾值線是一條平行于軸的直線,其缺省設(shè)置核酸拷貝數(shù)定量分析的金標(biāo)準(zhǔn);缺點(diǎn)是需要制備標(biāo)值通常為基線內(nèi)個(gè)循環(huán)熒光信號準(zhǔn)品,操作繁瑣對作人員的操作水平要求高。標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍熒光閾值線與產(chǎn)物擴(kuò)增曲線交法點(diǎn)的橫坐標(biāo)稱為循環(huán)閾值,表示熒光信號到達(dá)法的丁作原理是假設(shè)靶基因和參考基因的設(shè)定熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)”即可簡化為。在循環(huán)閾值擴(kuò)增效率均為,方程處處。,方程為,方程為熒光閾值通£。當(dāng)需要精確定量

5、核酸的拷貝數(shù)時(shí),通常采過手動(dòng)設(shè)置閾值線得到。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要計(jì)用方程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,常用的方法為絕對定量法,算擴(kuò)增效率,因此操作簡便,效率高,是目前用于相一不高又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線法當(dāng)需要對靶基因在表達(dá)對定量分析的主流方法之;缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度,特水平進(jìn)行相對定量分析時(shí),通常采用方程進(jìn)行數(shù)別是樣品中存在反應(yīng)的抑制劑時(shí),實(shí)際擴(kuò)增效率會據(jù)分析。在進(jìn)行相對定量分析時(shí),為了消除樣品濃顯著低于理想擴(kuò)增效率(因此分析結(jié)果中會度等因素引人的誤差,通常需要引入內(nèi)參基因?qū)Π写嬖谳^大誤差?;虻某跏寄0鍞?shù)量進(jìn)行校正。假設(shè)熒光閾值為雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理組樣品靶基因和參考基因的閾值循

6、環(huán)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的工作原理是擴(kuò)增系列濃度梯度分別為和,擴(kuò)增效率分別為瓦和良那么兩的標(biāo)準(zhǔn)品(數(shù)量未知)獲得各標(biāo)準(zhǔn)品的值,然后者的函數(shù)表達(dá)式分別為瓦廣(。表示處理以值為縱坐標(biāo)、初始模板數(shù)量的對數(shù)為橫組樣品靶基因的初始拷貝數(shù)和凡(瓦廣尺表坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析,通過斜率計(jì)算出擴(kuò)增效率示處理組樣品參考基因的初始拷貝數(shù))。經(jīng)內(nèi)參基(£。熒光閾值通過手動(dòng)設(shè)置閾值線得到。最因校正后處理組樣品中靶基因的初始模板數(shù)量為后將靶基因和參考基因的擴(kuò)增效率幻和值代入±同理對日組樣品中經(jīng)參考基因校但是需難建多條標(biāo)線,工作量大效率£低后的祀基因初腿板數(shù)量為和’目前僅用于對分析

7、結(jié)果要求研究。、線性回歸分析法分別為對照組樣品靶基因的初始模板數(shù)量一、擴(kuò)增線性回歸分析法的基本原理是直接從條產(chǎn)物效率和閾值循環(huán)數(shù),尺、艮和分別為對照組樣品擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增期內(nèi)采集數(shù)據(jù),以數(shù)據(jù)熒光中參考基因的初始模板數(shù)量、擴(kuò)增效率和閾值循環(huán)值)的對數(shù)為縱坐標(biāo)、循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)做圖,進(jìn)行數(shù)。因此靶基因在表達(dá)水平的相對變化量線性回歸,得到方程的斜率,繼而計(jì)算出擴(kuò)增效率由于參考基因的初始模板(幻。循環(huán)闊值通過手動(dòng)或自動(dòng)設(shè)置丨值獲,量在處理組和對照組中相同兄,所以靶基因的■’‘:■‘值代入方程得到分析結(jié)果。線性分斤法相對變化量《方程。方程是指主要包括法和

8、法。。數(shù)模型數(shù)據(jù)分析法進(jìn)行相對定量分析的一般方程。法首先在產(chǎn)物擴(kuò)增曲線上分別設(shè)置基于上述方程進(jìn)行相對定量分析的主要方法有—個(gè)低熒光值和一個(gè)高熒光值確定

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