電泳儀和毛細管電泳儀

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1、電泳儀和毛細管電泳儀胡水旺病理生理學(xué)教研室1第一節(jié)電泳帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis,EP)利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)2電泳發(fā)展簡史1897，Kohlausch推導(dǎo)出帶電粒子移動的理論公式20世紀(jì)初，Hardy發(fā)現(xiàn)許多生物膠體粒子的遷移率取決于電解質(zhì)溶液的pH值320世紀(jì)50年代，出現(xiàn)支持物的區(qū)帶電泳80年代后期，出現(xiàn)毛細管電泳，芯片電泳1937年瑞典化學(xué)家Tiselius將血清蛋白分成清蛋白、α1-、α2-、β、γ-球蛋白（移界電泳法）－+點樣線諾貝

2、爾獎4目前，電泳技術(shù)在生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和核酸的分離、分析和鑒定上具有巨大優(yōu)勢。生物化學(xué)與分子生物學(xué)的“常規(guī)武器”及常用工具。5電泳原理基本原理：不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，因此可使它們分離。6一、電泳遷移率（Electrophoresismobility）當(dāng)顆粒的摩擦力與電場力相等時：F=E?Q=f??f—摩擦系數(shù)f??帶電顆粒的電場力：F=E?Q?F+++++++______QEL7根據(jù)Stoke公式:f=6?????—顆粒半徑，?—介質(zhì)粘度因此:?=E?Q6????

3、不同物質(zhì)顆粒具有不同電泳速度8電泳遷移率或電泳淌度（?）?==?EQ6????適用于球形帶電粒子帶電粒子在單位電場強度作用下的移動速度9?===?Ed/t??U/LdL?t?U------++++--dAdBAB?d?d=dA-dB=(?A-?B)t?UL物質(zhì)間能否分離取決于它們遷移率的差異淌度不同是HPCE分離的基礎(chǔ)10二、影響電泳速度的因素1.粒子的性質(zhì)粒子的電荷量Q↗直徑?↘形狀接近球型?=E?Q6????電泳速度?↗2.電場強度電場強度E↗電泳速度?↗113.溶液的pH值等電點：蛋白質(zhì)（或兩性電解質(zhì)）所帶的凈電荷為0時溶液的pH值。此時

4、它們在電場中的遷移率為0。pH值離等電點越遠，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度?↗12兩性電解質(zhì)：兩性電解質(zhì)就是既能當(dāng)酸又能當(dāng)堿用的電解質(zhì)。兩性電解質(zhì)通常為兩性元素的氧化物的水合物、氨基酸等。4.溶液的離子強度Iq=I2Rtq:熱量;R:電阻；t:電泳時間；I:電流強度電場強度E↗離子強度I↗電流強度I↗過熱破壞支持介質(zhì)使分離物質(zhì)變性溶液的離子強度I↗，離子間的相互作用力越強，電泳速度?↘131).雙電層pH>3時，Si–OH→SiO-5.電滲作用石英毛細管142).電滲流（EOF）電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體電滲：電滲流：在高電場的作用下引起柱中的

5、溶液整體向一個方向移動的現(xiàn)象—SiO-？？--------------電泳緩沖液+-15電滲流方向電滲引起緩沖液從毛細管一端向另一端流動。一般方向是從陽極到陰極16電滲流形狀電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。┮合嗌V中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。？17電滲流的大小電滲流速度大于電泳速度帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和？？18--------------電泳緩沖液流動方向+—-----------------------+++

6、+++++++++++++++++合理利用電滲流可以使陽離子、中性分子、陰離子實現(xiàn)同時分離分析顆粒的電泳方向與電滲方向相同時，相對?↗？196.吸附作用（介質(zhì)對樣品的滯留作用）吸附作用越強，電泳速度?↘三.電泳的分類按電壓高低常壓電泳：100～500V按支持介質(zhì)區(qū)帶電泳高壓電泳：>500V自由電泳20電泳方法（一）紙電泳支持載體：濾紙21濾紙條水平架設(shè)樣品點于濾紙中央濾紙被潤濕蓋上絕緣密封罩輸入直流電壓特點：對蛋白質(zhì)吸附小，消除拖尾現(xiàn)象分離速度快電泳時間短樣品用量少22（二）醋酸纖維素薄膜電泳檢測微量異常蛋白特點：機械強度好、彈性大、透明、化學(xué)

7、穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品量小、分辨率高23（三）凝膠電泳利用pH值梯度介質(zhì)，分離等電點不同的蛋白質(zhì)24樣品各組分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH值位置成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。（四）等電聚焦電泳特點：樣品用量少、分辨率高電泳速度快、加入樣品的位置可意選任擇測定物質(zhì)的等電點中、大分子量生物組分的分離分析。采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個毛細管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強電場的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)

8、電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動，實現(xiàn)分離。25（五）等速電泳（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）26第一向：等電聚焦電泳（IEF）根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中