外源基因的表達(dá)(I)

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1、第六章外源基因的表達(dá)1基因工程的一個(gè)主要目的——基因表達(dá)：使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，改變生物性狀或產(chǎn)生人們所需要的產(chǎn)品（如：蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物）?；虮磉_(dá)——是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾后，最終表現(xiàn)出相應(yīng)的功能?；虮磉_(dá)的過程——包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯及翻譯后加工。它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用下完成的。2第一節(jié)基因表達(dá)機(jī)制1.1基因表達(dá)機(jī)制概述基因表達(dá)必備的條件：基因能夠轉(zhuǎn)錄：要求基因上游有“啟動(dòng)子”，調(diào)控元件、下游有“終止子”。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA能夠有效加工并保持穩(wěn)定。翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能

2、夠有效加工并保持穩(wěn)定。避免出現(xiàn)基因沉默31.3mRNA延伸和穩(wěn)定性轉(zhuǎn)錄啟始后,RNA聚合酶延伸mRNA,至終止子處終止。mRNA應(yīng)在細(xì)胞中保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)：mRNA有半衰期，必須不停轉(zhuǎn)錄，才能保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)?；蛏嫌斡袉?dòng)子，一般應(yīng)為誘導(dǎo)型；存在有效的誘導(dǎo)劑；沒有阻遏物。1.2外源基因的起始轉(zhuǎn)錄41.4mRNA的加工真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后需要剪切和拼接的加工過程。原核生物mRNA有效翻譯需考慮的基本原則：AUG（ATG）為起始密碼子SD序列應(yīng)包括AGGAGG中的4個(gè).SD序列與起始密碼子間距3-9bp起始區(qū)周圍序列無二級結(jié)構(gòu).外源基因的主密碼子與受體細(xì)胞的相同或接近.主密碼子:基因

3、組中使用頻率高的密碼子罕用密碼子:使用頻率低的終止密碼:E.coli.一般用UAA.RF1識別UAA,UAG.RF2識別UAA,UGA.1.5mRNA的翻譯5基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的動(dòng)畫演示真核生物基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯過程原核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程6避免表達(dá)蛋白降解的方法:采用融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)采用分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇無蛋白水解酶的受體。1.6表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性7基因沉默的形成機(jī)制主要有三種：位置效應(yīng)的基因沉默：整合入甲基化程度高、轉(zhuǎn)錄活性低的異染色體上，一般不表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：啟動(dòng)子的甲基化或外源基因的異染色質(zhì)體。轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：RNA水平上,

4、基因可轉(zhuǎn)錄,但mRNA合成后被降解或被反義RNA或蛋白質(zhì)封閉.轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中常見。1.7基因沉默8序列特異性：幾個(gè)保守的序列框。方向性：啟動(dòng)子正反兩種方向中只有一種具有啟動(dòng)功能。位置特性：啟動(dòng)子只能位于所基因的上游或基因內(nèi)的前端。種屬特異性：不同種屬、不同組織的啟動(dòng)子不同。第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件2.1啟動(dòng)子9原核生物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn):多為CAT,從第二個(gè)堿基開始。-10區(qū)：TATAAT，一般在起始位點(diǎn)上游6bp處。-35區(qū)：TTGACA，一般在起始位點(diǎn)上游35bp處。其中前個(gè)堿基高度保守間隔區(qū)：-10區(qū)與-35區(qū)存在長度不等的間隔區(qū)，序列無保守性，間隔的長度非常重要。一

5、般間隔16-18bp，E.coli.為17bp最好。真核生物啟動(dòng)子10能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子類似，由多個(gè)元件組成，每個(gè)元件與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)通常有一至多個(gè)增強(qiáng)子。每個(gè)均有一種特定的功能：如在特定的發(fā)育階段起作用。2.2增強(qiáng)子增強(qiáng)子的特性雙向性：正反方向均可重復(fù)序列：獨(dú)立行使功能功能的行使與位置無關(guān)：可上游、下游或中間特異性：功能行使有組織特異性或發(fā)育階段特異性?？烧{(diào)節(jié)同源基因，也可調(diào)節(jié)異源基因。11轉(zhuǎn)錄終止的位置分為本征終止子和依賴終止信號的終止子兩類。2.3終止子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始和終止.Trp操縱子2.4衰減子12第三節(jié)外源基因

6、表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。3.1定義13原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體受體細(xì)胞3.2種類外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體受體細(xì)胞14原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)3.2種類表達(dá)載體受體細(xì)胞153.3原核生物與真核生物間基因表達(dá)的差別原核生物基因表達(dá)真核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄加工翻譯加工修飾轉(zhuǎn)錄加工翻譯加工修飾16原核生物表達(dá)

7、系統(tǒng)基因表達(dá)：以操縱子形式進(jìn)行。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時(shí)，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA;與此同時(shí)，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時(shí)轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。mRNA只能在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化，形成高級結(jié)構(gòu)。3.3原核生物與真