微生物菌種選育(I)

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1、第二章菌種選育本章主要內(nèi)容第一節(jié)菌種的分離篩選第二節(jié)菌種選育第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯第一節(jié)菌種的分離篩選一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣

2、：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離篩選：采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌。發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。

3、從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。采取土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。離地面5~20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c、鏟

4、除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點、植被情況等。多點采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖，從而提高它們在樣品中的比例，便于分離。富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達(dá)到使目的菌種在群體中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生

5、物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。某些細(xì)菌的富集條件富集對象接種菌樣添加營養(yǎng)物(g)特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌土壤–好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌土壤，巴氏消毒–好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌土壤，巴氏消毒–厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒尿素50好氧，pH8.6厭氧八疊球菌土壤葡萄糖20厭氧，pH2~3乳酸菌植物體或牛奶葡萄糖20厭氧，pH6.5腸道細(xì)菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厭氧

6、，pH7.0丙酸菌干酪乳酸鈉20厭氧，pH7.0醋酸菌果實或生啤酒乙醇40好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培養(yǎng)在30℃下。（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。稀釋分離法稀釋倒平板法平板涂布法注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板。劃線分離法——平板劃線法（四）篩選1、初篩：

7、從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物篩選出來的過程。常用的初選方法：水解酶產(chǎn)生菌的篩選：將酶的作用底物加在培養(yǎng)基中，接種后適溫培養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否產(chǎn)生水解圈篩選出水解酶產(chǎn)生菌。一般采用平板篩選。拮抗菌的篩選—對峙培養(yǎng)：將病原指示菌與待測菌株相對接種在平板上適溫培養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長情況篩選出拮抗性菌株。分初篩、復(fù)篩。2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，取發(fā)酵濾液進(jìn)行活力測定。2、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步鑒定有希望菌株的生產(chǎn)能力強弱的過程。復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法進(jìn)行測定。復(fù)篩過程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進(jìn)行。培

8、養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基pH值發(fā)酵溫度供氧量等。（五）菌種鑒定經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗等?，F(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計算機數(shù)值