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1、·22·微生物學通報2006年33(6)應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測畢赤酵母的細胞活性3肖安風周祥山周利張元興(華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室上海200237)摘要:選取兩種細胞活性染色試劑二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate,FDA)和碘化丙錠(propidiumiodide,PI),應(yīng)用流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測畢赤酵母細胞活性。比較FDA/PI雙染色與PI單染色的FCM圖譜,后者能夠很好地將死活細胞區(qū)分開來并得到正確的比例。利用PI單染色檢測發(fā)酵過程細胞活
2、性的變化,甘油補料階段幾乎沒有細胞死亡,進入甲醇補料階段后,隨著細胞密度的增加,細胞的活性不斷降低,發(fā)酵88h時細胞活性僅為7318%。關(guān)鍵詞:流式細胞術(shù),檢測,畢赤酵母,細胞活性中圖分類號:Q2233文獻標識碼:A文章編號:025322654(2006)0620022205ApplicationofFlowCytometryinViabilityDetectionofPichiapastorisCells3XIAOAn2FengZHOUXiang2ShanZHOULiZHANGYuan2Xing(Sta
3、teKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237)Abstract:CellviabilityofPichiapastoriswasdetectedbyflowcytometry(FCM)withtworeagentsfluoresceindiacetate(FDA)andpropidiumiodide(PI)1ComparedwithFDA/PIdouble2st
4、aineddotplotsandPIsingle2staineddotplots,thelattercoulddividedeadandlivingcellsintotwoseparatezones,andgetthecorrectpro2portion1ThenPIsingle2stainedmethodwasusedtodetectthechangeofcellviabilityinPichiapatorisfermenta2tion1Atglycerolbatchandfed2batchphase,
5、littledeadcellsweredetected1Atmethanolfed2batchphase,cellviabilitydecreasedwhencellweightincreased,andwasonly7318%at88h1Keywords:Flowcytometry,Detection,Pichiapastoris,Cellviability[1]畢赤酵母作為一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng),得到了廣泛的應(yīng)用。然而,溫度、pH、[2]饑餓等多種壓力因素會使酵母細胞的活性降低甚至自溶,影響外源蛋白的
6、產(chǎn)量,因此,建立簡便、快速的細胞活性檢測方法對畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)具有實際意義。[3][4]目前檢測酵母細胞活性的常規(guī)方法有菌落計數(shù)法、美藍染色法、比氧消耗速[5]率檢測法等,這些方法均具有操作復雜、檢測靈敏度差和耗時等缺點。近年來,流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)作為一種有效的且有價值的方法常常用來替代常規(guī)方[6]法檢測微生物活性。流式細胞儀可以一次性檢測細胞群體中的幾千個細胞,使研究人員建立個體細胞在群體中的多維表象,自動化程度高,每次檢測能獲得非常大的信息量。流式細胞技術(shù)在動物細胞的周期
7、分析中得到了大量的應(yīng)用,然而,該技術(shù)在畢赤酵母細胞檢測方面的報道還比較少,處于研究階段。本文選取了FDA和PI兩種熒光染料,利用流式細胞儀檢測酵母的細胞活性,將其與美藍染色法進行比較,最后利用流式細胞儀對畢赤酵母發(fā)酵過程的細胞活性進行檢測。3通訊作者Tel:021264253025,E2mail:yxzhang@ecust1edu1cn收稿日期:2006201215,修回日期:20062032222006年33(6)微生物學通報·23·1材料與方法111菌株與培養(yǎng)基[7]表達重組水蛭素(rHV22Lys4
8、7)的畢赤酵母基因工程菌,由山東東阿阿膠股份有限公司提供。種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基見文獻[7]。112儀器與試劑FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。碘化丙錠(PI)溶液:1mgPI溶于1mL去離子水中,4℃避光保存。二乙酸熒光素(FDA)溶液:5mgFDA溶于1mL丙酮中,4℃避光保存。美藍染色液:美藍011g/L,檸檬酸鈉20g/L。113細胞培養(yǎng)5種子培養(yǎng):2L三角瓶中裝入500mL種子培養(yǎng)基,1×
