pH熒光探針的研究進(jìn)展

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1、第21卷第2期分析科學(xué)學(xué)報(bào)2005年4月Vol.21No.2JOURNALOFANALYTICALSCIENCEApr.2005文章編號(hào):1006-6144(2005)02-0210-05pH熒光探針的研究進(jìn)展*蘇美紅,聶麗華,馬會(huì)民(中國科學(xué)院化學(xué)研究所分子科學(xué)中心,生命分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,北京100080)摘要:本文評述了近二十年來熒光素類、半萘酚羅丹熒類、金屬配合物類、8-羥基芘-1,3,6-三磺酸鹽等pH熒光探針的發(fā)展。按種類分別討論了其熒光隨pH變化的性質(zhì)、適用的pH測定范圍以及分析應(yīng)用。引用文獻(xiàn)56篇。關(guān)鍵詞:pH;熒光探針;綜述

2、中圖分類號(hào):O657文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A[1,2]化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行或完成,細(xì)胞和細(xì)胞器的許多重要生理過程等都與pH值密切相關(guān)。在正常的+生理?xiàng)l件下,細(xì)胞外液中H的濃度約為40nmol/L(pH=7.40),其變動(dòng)幅度一般在0.1~0.2個(gè)pH單[3]位。酸性和堿性過強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致心、肺病變或神經(jīng)類疾病,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)猩ｋU(xiǎn)。因此,pH值的精確測量對化學(xué)生物學(xué)研究十分重要。測定pH值一般用玻璃電極,但由于存在電化學(xué)干擾、可能的機(jī)械損傷[1][4]等缺陷而不適于活體pH監(jiān)測;此外,玻璃電極也不適于極端pH的測量。眾所周知,一些有機(jī)化合物的熒光或吸光性質(zhì)隨

3、pH的變化可用來指示目標(biāo)介質(zhì)中酸堿性的改[5-7][8,9]變。這種基于光學(xué)信號(hào)變化而建立的pH測定方法,可彌補(bǔ)玻璃電極所存在的上述不足,并得到[10-13]了長足的發(fā)展。其中,熒光法測定pH具有靈敏度高、可以采用緩和模式操作(這種技術(shù)特別適合研[14,15]究混濁和非均勻體系),分析儀器的幾何設(shè)計(jì)更加靈活等特點(diǎn)。此外,利用各種熒光參數(shù)(如熒光強(qiáng)度、熒光壽命等)的變化來測定pH值,不僅便于熒光顯微學(xué)研究,而且可實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)分布[16]和區(qū)域變化,引起了人們的關(guān)注。本文就目前pH熒光探針的種類及應(yīng)用作一簡要的評述。1熒光素及其衍

4、生物熒光素分子的熒光發(fā)射波長較長、量子產(chǎn)率高(在0.1mol/LNaOH中,U=0.9)的特性使其成為測定pH的首選熒光探針之一。隨著pH的變化,熒光素有著不同的解離形式,其中只有兩種陰離子形式的[17]熒光素有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。當(dāng)pH接近pKa=6.5時(shí),其吸收光譜出現(xiàn)紅移,且兩個(gè)不同激發(fā)波長處的[17]熒光強(qiáng)度的比值與pH的變化呈線性相關(guān),據(jù)此,可實(shí)現(xiàn)比率法測定近中性范圍內(nèi)的pH變化。不過,熒光素分子易于從細(xì)胞內(nèi)流失的缺陷,使其不適用于一些細(xì)胞參數(shù)與組分的表征。對此,人們發(fā)展了各種熒光素衍生物以克服之。[18]Ohkuma等以異硫氰酸酯

5、熒光素標(biāo)記右旋糖苷,標(biāo)記產(chǎn)物的熒光在pH4~7范圍內(nèi)具有敏感響[19]應(yīng),籍此測得了巨噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)正常的pH值范圍為4.7~4.8。Thomas等利用熒光素的甘油二脂+衍生物測定了EhrlichAscites腫瘤細(xì)胞內(nèi)的H濃度變化。熒光素衍生物還常用于制備各種pH傳感器[20,21][22]件,Munkholm等將熒光素胺結(jié)合在丙烯酰胺-亞甲基二(丙烯酰胺)共聚物上,制得了pH值響應(yīng)范圍為4.0~8.0的熒光傳感器。與熒光素相比,2c,7c-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基熒光素(BCECF)不易透過細(xì)胞膜,且pKa=6.98,更接[2

6、3-31][27]近于中性,故更適于測定各種生理?xiàng)l件下pH的變化。Salvi等利用BCECF熒光光譜隨pH變化+的性質(zhì),通過測定酯類藥物水解生成的H,探討了酶對酯類藥物的催化水解作用。Slavik等藉BCECF在兩個(gè)激發(fā)波長(Kex=490nm和Kex=435nm),或在兩個(gè)發(fā)射波長(Kem=518nm和Kem=529nm)處的收稿日期:2002-12-09通訊聯(lián)系人:馬會(huì)民210第2期分析科學(xué)學(xué)報(bào)第21卷[28]熒光強(qiáng)度比值,用比率法測定了單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)的pH值和膜電位;不同的pH環(huán)境可引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH[29]值的變化,從而可考察細(xì)胞質(zhì)在

7、中性范圍內(nèi)的緩沖能力。大腦局部缺血會(huì)引起細(xì)胞外液酸多癥(或稱[30]酸毒癥),此癥狀是中樞神經(jīng)受損的重要體現(xiàn)。Itoh等利用BCECF研究了活體貓腦部局部缺血和再循環(huán)過程中,其大腦皮層細(xì)胞內(nèi)pH值隨時(shí)間的變化,并發(fā)現(xiàn)貓腦局部嚴(yán)重缺血時(shí),大腦細(xì)胞內(nèi)pH值降低許多,而且在恢復(fù)循環(huán)后這種酸性狀態(tài)至少會(huì)持續(xù)30min。通過對清醒狀態(tài)的裸鼠細(xì)胞外液中的pH[31]進(jìn)行無損、連續(xù)測定,揭示出裸鼠胞內(nèi)pH值約為7.5,變化幅度為vpH=0.05。[32]Glaasker等利用異硫氰酸酯熒光素和谷氨酸酯反應(yīng),制得了N-(熒光素硫脲基)谷氨酸酯。該探針的p

8、Ka值(6.9)比BCECF的pKa值略低,但用于pH測定時(shí)受KCl的影響較小。半萘酚熒光素類(SNAFLs)探針的激發(fā)和發(fā)射光譜在pKa=7.6~7.9范圍內(nèi)均發(fā)生漂移,故可用比[33,34