質粒的提取及凝膠糖凝膠電泳鑒定

《質粒的提取及凝膠糖凝膠電泳鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。

1、實驗五質粒DNA的提取鑒定掌握堿變性法從大腸桿菌中提取質粒DNA原理和方法。掌握瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒DNA的技術。一、實驗目的質粒（plasmid）是一種獨立的穩(wěn)定的遺傳因子，存在于細菌等細胞中。它們?yōu)殡p鏈、閉環(huán)的DNA分子，大小從1kb到200kb不等，具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達所攜帶的DNA基因信息，但其復制和轉錄要利用宿主細胞編碼的一些酶和蛋白質，而宿主在沒有質粒時是可以正常生長的。因此，質粒是一種寄生性的自主復制子。細菌質粒是基因工程中常用的基因載體，也是分子生

2、物學中研究基因結構、功能及其復制、表達的好材料。二、實驗原理堿變性抽提法法是常用的方法之一.此法基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性差異而達到分離的目的。在pH高達12.6的條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂、雙螺旋解開而變性；質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈未完全分離，當用pH4.8的Kac高鹽緩沖液調節(jié)pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，以可溶性狀態(tài)存在于液相中，而染色體DNA不能復性，形成纏繞的網狀結構，與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質等一起沉淀出來。二

3、、實驗原理抽提中各種因素的影響，質粒DNA可能以三種形式存在：1.共價閉環(huán)DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA），常以超螺旋形式存在；2.開環(huán)DNA（opencircularDNA，ocDNA），此種質粒DNA的兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，形成缺刻，可以自由旋轉從而消除了張力，形成松弛的環(huán)狀分子；3.線狀DNA（linearDNA，lDNA），質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂所形成。在電泳時，同一質粒DNA的泳動速度根據(jù)遷移率從小到達分別為開環(huán)，線形和超螺旋D

4、NA。cccDNA含量越高，表明制備的質粒DNA質量越好。三、操作步驟1.取2ml細菌培養(yǎng)液于2mlEppendorf離心管中，4℃，5000rpm，離心5min，棄上清（將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體盡可能流盡），保留菌體沉淀。2.沉淀懸浮于100ul預冷的試劑Ⅰ（TEG緩沖液）中，混勻（置混合器振蕩），冰上置10min。3.加入新配制的試劑Ⅱ（堿裂解液）200ul，加蓋，輕輕顛倒3～4次，冰上置10min。4.加入預冷的試劑Ⅲ（乙酸鉀溶液）150ul，蓋緊管蓋，顛倒數(shù)次，冰上置10min。12000

5、rpm，4℃，離心10min，以除去細胞碎片及大部分細菌染色體DNA。5.上清液移入另一干凈離心管中，加入等體積的平衡酚輕搖，12000rpm，4℃，離心10min。6.取上層水相置于另一離心管中，加入等體積的氯仿（氯仿：異戊醇=24：1）抽提，12000rpm，4℃，離心10min。7.取上層水相置于另一離心管中，加入2倍體積的預冷的無水乙醇，混勻后置—20℃過夜（至少要放置2h以上）。8.12000rpm，4℃，離心10min，棄上清，將管口倒置于紙巾上使所有液體盡可能流出。9.加入1ml70%乙醇洗

6、沉淀一次。12000rpm，4℃，離心10min。10.棄上清，將管口倒置于紙巾上使液體流盡，放置干燥或真空干燥，即得質粒DNA制品。11.將沉淀溶于20ulTE緩沖液，（臨用前加入1u或20ug/mlRNaseA）待用。50mM葡萄糖25mMTris-HCl10mMEDTA-Na2200mMNaOH1%（W/V）SDS3MNaAC省去25min30min以上實驗步驟不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構型的不同，在電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶。核酸構型不同，在凝膠中的電泳速度差別

7、較大。同一質粒DNA的泳動速度次序為：共價閉環(huán)DNA＞開環(huán)DNA＞線狀DNA。溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在波長254nm紫外光照射下插入溴化乙錠的DNA顯橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作熒光指示劑指示DNA含量和位置。四、DNA的瓊脂糖凝膠電泳原理1.瓊脂糖凝膠的制備：本實驗采用1.0%的瓊脂糖凝膠。稱取0.3g瓊脂糖放入錐形瓶，加入30ml電泳緩沖液，置于微波爐使其充分融化。室溫放置至60℃左右，加入EB使其終濃度為0.5ug/ml，混勻，倒膠板（30ml/板）。2.凝膠板的制作：用1cm寬的膠

8、帶紙沿平板電泳槽模板兩端邊緣圍成高4mm的墻，在其一端放置樣品梳。將準備好的模板置于水平臺上，迅速將上面膠液倒在模板的中央，讓膠液自由流向四周。待膠液充分冷卻凝固，將膠紙圍墻慢慢取下，制備好的凝膠板放入電泳槽中，加電泳緩沖液直至沒過膠面約1mm深，取出樣品梳。五、瓊脂糖凝膠電泳操作步驟3.加樣：10ulTE溶解+4ul上樣緩沖液，取10ul點樣4.電泳：電壓：120V電泳時間：45min電泳終止：指示劑距離凝膠前沿約1cm處5