腫瘤細(xì)胞侵襲實驗2

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1、腫瘤細(xì)胞侵襲實驗?zāi)J(rèn)分類2009-09-2500:25:58閱讀100評論0字號：大中小Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動才能穿過這種鋪有Matrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Matrigel的濾膜放在以BlindWell腔或MI

2、CS腔上下室之間，鋪有Matrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運(yùn)動。細(xì)胞穿膜所用的時間與Matrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析

3、，這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMatrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWell腔中培養(yǎng)72小時后，有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。在上述分析中，如果不在膜上鋪Matrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過變形運(yùn)動穿過濾膜，用

4、這種模型對分析細(xì)胞運(yùn)動能力和藥物對細(xì)胞運(yùn)動能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。1、Matrigel基質(zhì)膠（威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分裝成0.5ml/只10個EP管中；用時加入0.5ml的DMEM；Matrigel在冰上維持液態(tài)，室溫時可迅速凝結(jié)成膠。使用前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），避免反復(fù)凍融。使用時需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃；注意無菌操作；2、24

5、-transwell(Coster)；3、結(jié)晶紫染料溶液：結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用濃度為0.1％，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；4、33%醋酸；1、溶液配制：（1）溶DMEM500ml；NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）母液0.1ml（5mg）+ddH2Oupto5ml；過濾消毒，-20℃保存。NE-DMEM（-6M）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（2）NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）NE---A液（1μg

6、/μl，1mg/ml）20.5μlCGRP-儲存液50μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（3）NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlIFN-γ（25ng/μl）25μlDMEMUPTO100ml過濾消毒，4℃保存（4）低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）（5）20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）2、準(zhǔn)備（1）溶膠，4℃過夜（ThawMatrigelat4℃overnight.）（2）室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗前-2

7、0C預(yù)冷。（Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.）3、包被基底膜（冰上操作）（1）用無血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/mlto5mg/ml)）（DiluteMatrigel(10mg/mlto5mg/ml)inserumfree-coldcellculturemedia(R

8、PMI1640,EMEM,DMEM,etc).）（2）取100ul稀釋膠加到24-welltranswell上室中（Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell）（3）37℃孵育transwell至少4-5h（Incubatethetranswellat37Catleast4to