PCR_RFLP技術(shù)應(yīng)用于鑒定美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的初步研究

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1、第18卷武夷科學(xué)Vol.182002年12月WUYISCIENCEJOURNALDec.2002文章編號(hào):1001-4276-(2002)01-0060-05PCR-RFLP技術(shù)應(yīng)用于鑒定美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的初步研究陳萍,溫碩洋,曾玲(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)研究室,廣州510642)摘要本文試探運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù),從美洲斑潛蠅(Liriomyzasativae)和番茄斑潛蠅(Liriomyzabryoni-ae)中提取總的DNA,根據(jù)實(shí)蠅18S和5.8S保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增這兩種斑潛蠅的I

2、TS1基因區(qū)域,用五種限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,構(gòu)建了酶切圖譜。從酶切圖譜中選擇特異酶切位點(diǎn)作為區(qū)分兩種斑潛蠅的標(biāo)記。根據(jù)特異的酶切片段來(lái)區(qū)分這兩種斑潛蠅。關(guān)鍵詞美洲斑潛蠅,番茄斑潛蠅,ITS1,PCR-RFLP,限制性酶切圖譜中圖分類號(hào):Q953文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A1前言斑潛蠅屬全世界已知300多種,許多種類因其寄主較廣,危害嚴(yán)重,被許多國(guó)家和地區(qū)列為重要的檢疫性害蟲(chóng)。中國(guó)大陸及臺(tái)灣至今已知有14種(楊龍龍,1995),其中全國(guó)境內(nèi)檢疫的種類有:美洲斑潛蠅(Liriomyzasativae),番茄

3、斑潛蠅(Liriomyzabryoniae),南美斑潛蠅(Liri-omyzahuidobrensis),三葉草斑潛蠅(Liriomyzatrifolii)四種。其中,美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅在廣東省各地區(qū)分布廣,為害嚴(yán)重。斑潛蠅屬各個(gè)種的外部形態(tài)極其近似,幼蟲(chóng)、蛹更難從形態(tài)上區(qū)分。而且檢疫工作中發(fā)現(xiàn)的斑潛蠅多為幼蟲(chóng)或蛹,難于及時(shí)地進(jìn)行形態(tài)鑒定,為檢疫帶來(lái)了不便。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為檢疫害蟲(chóng)的及時(shí)鑒定提供了快捷而準(zhǔn)確的途徑。用于種類分子鑒定的技術(shù)有很多,新的方法也在不斷的發(fā)表,比如設(shè)計(jì)特異引物來(lái)擴(kuò)增目

4、的基因、RAPD、目的基因的PCR-RFLP、AFLP、微衛(wèi)星DNA、以及目的基因的直接測(cè)序等,PCR-RFLP是其中一種較為容易、快速、可靠的方法。真核生物細(xì)胞核基因組中的rDNA是由編碼區(qū)和非編碼區(qū)所構(gòu)成的一個(gè)重復(fù)單位。編碼區(qū)包含18S、5.8S和28S亞單位,在進(jìn)化中是較為保守的,通常作為屬以上階元的遺傳標(biāo)記;非編碼區(qū)包括ITS1(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1)和ITS2(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2),進(jìn)化速度較快,適合于種級(jí)或種群間的遺傳多樣性分析;ITS1片段位于18S和5.8SrDNA之間,是研究種和種群遺傳多樣性

5、一種常用而有效的分子標(biāo)記之一。根據(jù)生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,不同物種的DNA序列會(huì)產(chǎn)生不同程度的變異,從而體現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的不同,酶切后會(huì)產(chǎn)生不同數(shù)量的酶切片段以及片段大小的差異,由收稿日期:2002-06-10第18卷陳萍等:PCR-RFLP技術(shù)應(yīng)用于鑒定美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的初步研究·61·此構(gòu)建酶切圖譜。本文參考實(shí)蠅的18S和5.8S的保守序列設(shè)計(jì)了適合斑潛蠅的特異引物,對(duì)美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的模板DNA進(jìn)行ITS1基因區(qū)域擴(kuò)增,用5種識(shí)別4堿基對(duì)的限制性內(nèi)切酶(AfaⅠ、MaspⅠ

6、、HaeⅢ、MboⅠ、AluⅠ)分別對(duì)PCR擴(kuò)增的ITS1基因區(qū)域進(jìn)行酶切并比較,初步探討PCR-RFLP運(yùn)用于鑒定美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的可行性和可靠性。2材料與方法2.1材料2.1.1蟲(chóng)源美洲斑潛蠅在廣州市郊岑村采集,番茄斑潛蠅在珠海斗門采集。供試蟲(chóng)均浸于95%乙醇中用于模板DNA的制備。2.1.2試劑五種限制性酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,EDTA、瓊脂糖購(gòu)自基因有限公司,SDS為Serva有限公司進(jìn)口分裝;dNTPs、TaqDNA聚合酶購(gòu)自華美生物工程公司;GeneRuler(tm)10

7、0bpDNAmarker購(gòu)自上海生物工程公司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。18SF的引物序列為:5'—GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3'5.8SR的引物序列為:5'—GTCCTGCAGTTCACACGATG—3'2.2方法2.2.1總DNA的抽提按照昆蟲(chóng)生態(tài)研究室昆蟲(chóng)基因多樣性實(shí)驗(yàn)室痕量樣品快速抽提DNA的方法(溫碩洋等,待發(fā)表):取斑潛蠅1頭,若標(biāo)本是用酒精泡的,先用TE泡半小時(shí);若是干標(biāo)本,則要先用水軟化過(guò)夜,然后再用TE泡。從處理后的樣品中切出帶有肌

8、肉的一小部分腹部體壁,置于30ul的研磨緩沖液(100mMTris-cl,1mMEDTA,25mMNacl,200ug/mlProteinaseK)中,用燒鈍的tip頭充分研磨,再用30ul的研磨緩沖液洗滌tip頭,約60ul的研磨液置56℃溫浴消化2個(gè)小時(shí)。消化后,95℃溫浴45秒使蛋白酶K變性,2000～3000rpm/min離心30秒沉淀雜質(zhì),上清液作為做PCR的DNA模板,-20℃下貯存?zhèn)溆谩?.2.2PCR(Polymerasechainrea