定量PCR 引物、探針設(shè)計(jì)原則

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1、定量PCR引物、探針設(shè)計(jì)原則自90年代Taqman探針誕生以來(lái)，雖然熒光探針（引物）不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)，但是作為一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，Taqman探針技術(shù)仍然是許多實(shí)驗(yàn)研究人員進(jìn)行定量檢測(cè)的首選，這主要是因?yàn)橄鄬?duì)于SYBR熒光染料，Taqman探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)，而且熒光信號(hào)與擴(kuò)增的拷貝數(shù)具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此特異性強(qiáng)靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易；而相對(duì)于雜交探針，Taqman探針只要設(shè)計(jì)一條探針，因此探針設(shè)計(jì)較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。當(dāng)然Taqman定量方法由于還是要合成探針，也給實(shí)

2、驗(yàn)操作帶來(lái)了挑戰(zhàn)。一般Taqman定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：目的基因查找比對(duì)→探針與引物設(shè)計(jì)→探針與引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化條件→獲得曲線數(shù)據(jù)，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線→再重復(fù)驗(yàn)證?！〉谝徊剑涸诘谝徊侥康幕虿檎冶葘?duì)過(guò)程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA的查找與比對(duì)——這在分析測(cè)序報(bào)告的時(shí)候相信很多人操作過(guò)，這一步需要注意的就是要保證所分析的序列在一個(gè)contig（重疊群，即染色體的一些區(qū)域中毗鄰DNA片段重疊的情況）內(nèi)?！〉诙剑喝绻渌鼦l件一致，那么這個(gè)第二步——

3、引物探針的設(shè)計(jì)就可以說(shuō)是定量PCR成敗的關(guān)鍵了，通過(guò)各方面經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)有以下幾個(gè)基本的原則：?總體原則先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段——這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的最好能在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生

4、非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)。為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。　?引物設(shè)計(jì)原則序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)?典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特

5、異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃（因?yàn)?0℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp?引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過(guò)2個(gè)的G和C。　?探針設(shè)計(jì)原則探針位置盡可能地靠近上游引物探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)Tm值在

6、65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探針的5’端應(yīng)避免使用G鳥(niǎo)嘌呤——因?yàn)?'G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針?！?TaqmanMGB探針設(shè)計(jì)探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。Tm值

7、應(yīng)為65-67℃。?盡量縮短TaqmanMGB探針，但探針長(zhǎng)度不少于13bp。盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。?原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到(MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào))。因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即TaqmanMGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離3’端2個(gè)堿基的

8、前方(即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是絕對(duì)的保守)，以進(jìn)行SNP檢測(cè)。反過(guò)來(lái)，若要進(jìn)行同類檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個(gè)bp，探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)