重疊PCR—overlap PCR

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1、重疊PCR—overlapPCR1.簡(jiǎn)介重疊PCR也是基本的PCR原理：變性-退火-延伸。不同的是在重疊PCR過(guò)程是兩個(gè)或者幾個(gè)片段重疊延伸之后，再進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增的PCR過(guò)程。2.基本原理第一步：PCR產(chǎn)生兩個(gè)或者幾個(gè)片段，這幾個(gè)片段之間必須有重疊區(qū)。第二步：以?xún)蓚€(gè)片段為例，見(jiàn)上圖，第一步產(chǎn)生的兩個(gè)片段，AD鏈之間有互補(bǔ)，BC鏈之間也有互補(bǔ)，但只有AD鏈互補(bǔ)重疊延伸產(chǎn)生所需要的重疊片段。第三步：第二步產(chǎn)生的重疊產(chǎn)物，在上下游引物的存在下，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程。請(qǐng)仔細(xì)看清楚原理，特別是第二步。3.實(shí)際操作注意點(diǎn)a.第一步PCR之后

2、的產(chǎn)物，可以純化，也可以吸取幾μL作為重疊PCR的模板。b.第二步和第三步一起稱(chēng)為重疊PCR，實(shí)際發(fā)生過(guò)程分為兩個(gè)步驟。c.Taq酶會(huì)在末端加A，高保真酶有3’—5’的外切活性，基于重疊PCR原理和酶的性質(zhì)，第一步和重疊PCR步驟至少有一步使用高保真酶（或者如TaqPlus、EsTaq之類(lèi)的，有3’—5’的外切活性），如果第一步和重疊PCR都使用普通Taq可能重疊PCR會(huì)失敗。d.基于重疊PCR原理，上圖中第二步AD鏈直接的退火很關(guān)鍵，所以有些protocol會(huì)建議重疊PCR分兩個(gè)程序進(jìn)行也是基于以上原理。重疊區(qū)的Tm很關(guān)鍵，或

3、者說(shuō)退火溫度很重要。4.重疊PCR幾個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景a.片段中間引入突變b.片段中間引入缺失C.片段中間引入插入片段d.片段拼接(如不同結(jié)構(gòu)域DNA片段拼接)e.長(zhǎng)片段分段擴(kuò)增，再重疊PCR拼接。f.從基因組擴(kuò)增出外顯子，再拼接出完整的CDS區(qū)。