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《黃芪甲苷對體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞增殖作用影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、黃英甲昔對體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞增殖作用影響摘要：目的觀察黃茂甲昔對體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞增殖作用的影響，并探討其作用機理。方法體外分離培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)干細胞，Nestin免疫細胞化學染色進行神經(jīng)干細胞的鑒定，BrdU標記鑒定增殖。采用稀釋法檢測黃英甲昔高、中、低劑量組(6、0.6、0.06?mol/L)對體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞增殖作用的影響。結(jié)果Nestin染色為陽性,BrdU的增殖鑒定為陽性。與對照組相比，黃英甲昔高、中、低劑量組神經(jīng)球生成數(shù)目明顯增加。結(jié)論黃茂甲昔能夠明顯增加神經(jīng)球生成數(shù)目，具有促進胚胎神經(jīng)干細胞體外增殖的作用。關鍵詞：神經(jīng)干細胞；黃英甲昔；增殖D0I
2、：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1005-5304(2013)05-0042-03學基礎［1］。近來，很多研究表明，NSCs和神經(jīng)前體細胞的替代移植療法對治療腦和脊髓損傷、帕金森病及周圍神經(jīng)損傷等神經(jīng)組織疾病具有強大的應用價值［2-5］o中醫(yī)藥療法在神經(jīng)元保護和修復方面顯示了一定作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃英不同提取物具有抗氧化、抗炎、擴張血管、改善腦血流等作用［6］。黃茯甲昔是從黃茂總昔中分離得到的一類單體化合物，是黃茂的主要活性成分之一。本實驗采用黃竄甲昔對大鼠胚胎干細胞增殖作用進行研究
3、，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的修復提供實驗基礎和臨床應用依據(jù)。1實驗材料1.1培養(yǎng)基、試劑與藥物HBSS液(無鈣離子和鎂離子，LONZA,USA)；DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液(HycloneLaboratories,USA)；B27添加物(GIBCO,USA)；重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,ProSpec-Tany,Isreal)；人表皮生長因子(EGF,StrathmannBiotec,Germany)；青霉素-鏈霉素溶液(雙抗，100X，Sigma)；Nestin小鼠單克隆抗體(SantaCruz,USA)；BrdU小鼠單克隆抗體(Sigma,German
4、y)；ABC試劑盒(VectorLaboratories,USA)；DAB試劑盒(VectorLaboratories,USA)；黃英甲昔、丹酚酸B(天津中一制藥)。1.2儀器MC0-5M型02/C02孵箱(Sanyo,Japan)；CK30倒置顯微鏡、1X70熒光倒置顯微鏡(Olympus,Japan)o2實驗方法2.1神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)及傳代孕16dSD大鼠，脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下打開腹腔，取出串珠狀子宮，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剝離外層骨膜，取出大腦皮質(zhì)并去除軟腦膜，冷HBSS液漂洗2次，轉(zhuǎn)移至離心管加入一定量冷H
5、BSS,吹打呈均勻懸濁狀，過200目(70?m)篩網(wǎng)，1000r/min離心8min,棄上清，以全培基(含2%B27,20?g/LbFGF,20?g/LEGF的DMEM/F12,1%雙抗的HBSS液)重懸，約3?4個胎鼠/75cm2的密度種入培養(yǎng)瓶中，37°C.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2?3d行半量換液1次。約5?9d傳代1次。傳代后以1X105個/mL的密度全培基重懸種入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。2.2神經(jīng)干細胞亞代克隆Nestin鑒定將經(jīng)過多次連續(xù)傳代所形成的亞代克隆細胞球接種于預先置有50?g/mL多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中，貼壁生長2ho經(jīng)4%多聚甲醛固定后，0.3%T
6、ritonX-100室溫通透，正常血清封閉，滴加Nestin小鼠單克隆抗體，行ABC法免疫組織化學染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光學顯微鏡下觀察照相。2.3神經(jīng)干細胞BrdU標記及增殖鑒定將NSCs亞代克隆細胞球制成lX105/mL的細胞懸液，培養(yǎng)3d后摻入BrdU(10?mol/L),24h后吹散NSCs克隆球，收集細胞接種于預先置有50?g/mL-多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中，貼壁生長2ho經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用鹽酸變性硼酸中和，然后以正常血清封閉。滴加單克隆Anti-BrdU抗體（1:800）,41過夜，行ABC法免疫組織化學染色，并以蘇木素復染，以50%
7、甘油封片，在普通光學顯微鏡下觀察照相。2.4有限稀釋法檢測黃英甲昔對神經(jīng)干細胞的增殖作用將NSCs克隆球制成1X105個/mL的單細胞懸液，將該細胞懸液稀釋240倍，分別加入0.035?mol/L丹酚酸B和不同劑量的黃英甲昔（6、0.6、0.06?mol/L）,種入24孔板。共設5組（對照組、丹酚酸B組及黃英甲昔高、中、低劑量組），每組4孔。常規(guī)培養(yǎng)4d后對神經(jīng)球進行計數(shù)（包含細胞25）。3統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以一x土s表示，采用方差分析。P5討論NSCs源于胚胎干細胞和成年干細
