最權(quán)威最齊全的PCR匯總及其原理,程序

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1、RTPCRTPCR-RT-PCR簡(jiǎn)介反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄嗨的作用從RNA合成cDNA,旳以cDNA為模板，擴(kuò)增合成冃的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞屮基因表達(dá)水平，細(xì)胞屮RNA病毒的含量和肓接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)

2、論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA陸和基因組DNA的污染。RTPCR-原理只要是利用相關(guān)技術(shù)提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNAo再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RTPCR-過(guò)程RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在反轉(zhuǎn)錄緩沖液小進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，在同時(shí)為反轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，反轉(zhuǎn)錄和P

3、CR在一直觀眾順次進(jìn)行。1、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇RT-PCR兩種方法連用予rnRNAIt這受群析?TwoStepRTPCR叢早古?

4、種。對(duì)于短的不具冇發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種都可。一步法實(shí)匕示意0B（卿一個(gè)反總管中）<-d步法RT-PCR引物的選擇:1?隨機(jī)引物適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAo確于rRNA>niRNA、tRNA等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。合成法示倉(cāng)8B（兩步濟(jì)》??u

5、解也會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成儀人人減少。3.基因特異性引物與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的悄況。RTPCR-影響因素RT-PCR反應(yīng)受多個(gè)因素影響，如硫酸鎂的濃度，引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。1、建議選擇0.5-3.0mM（相差0.5mM）的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。2、對(duì)于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時(shí)的溫度對(duì)反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。3、人多數(shù)口標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果口標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。反向PCR反

6、向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA,也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物Z間而是在引物外側(cè)合成DNAo反向PCR-簡(jiǎn)介PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，反向PCRnJ'擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR,,是指擴(kuò)增mRNA的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。3?PfiEXlAZBmRlWmRUACWAJWAAAg1SuperRnaseK伍T(mén)jReverseTransmptasc3^PC

7、RTWVTTTTTTRT-PCR反應(yīng)原理反轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)乂稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,釆用0ligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得冃的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了兒個(gè)數(shù)雖級(jí)，使一些極為微屋RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA髙效轉(zhuǎn)

8、錄系統(tǒng)。RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)即逆轉(zhuǎn)錄PCR,是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR