基因克隆及蛋白表達(dá)

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1、基因克隆及蛋白表達(dá)細(xì)胞生物學(xué)教研室李　豐研究某一目的基因功能一般策略目的DNA獲得來自三條途徑:1.genome上的特定區(qū)域或序列2.含有目的DNA的質(zhì)粒3.從cDNA文庫中擴(kuò)增單個已知cDNA獲得目的DNA構(gòu)建含目的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌?蛋白表達(dá)純化轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞?蛋白定位、表達(dá)及表型變化第一部分PCR聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)是20世紀(jì)80年代后期由K.Mullis等建立的一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)。PCR是利用針對目的基因所設(shè)計的一對特異寡

2、核苷酸引物，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便等特點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。一、PCR實(shí)驗(yàn)原理一、PCR實(shí)驗(yàn)原理二、PCR的反應(yīng)體系1.PCR引物（1）primer長度：18-30bp引物短?特異性降低引物長?影響產(chǎn)物生成（2）primer濃度：0.1-1.0umol/L濃度過高?錯配、引物二聚體增加濃度過低?PCR效率降低二、PCR的反應(yīng)體系2.緩沖液KCl、Tris-Cl、MgCl2，Mg2+：1.5～2.0mMMg2+:DNA聚合酶活性PCR產(chǎn)量Mg2

3、+:PCR反應(yīng)特異性二、PCR的反應(yīng)體系3.DNA聚合酶TaqDNA聚合酶LADNA聚合酶PrimeSTAR(PyrobestDNA聚合酶)PfuDNA聚合酶TaqDNApolymerase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘5’?3’DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的條件下，以dNTP作為底物，沿5’?3’方向合成與模板互補(bǔ)的DNALATaqDNAPolymerase1.5’?3’DNA聚合酶活性；2.3’?5’DNA外切酶活性。Pyrobest&pfuDNAPolymeraseTaqDNA聚合酶活性3’?5’外切酶活性，

4、可信度極高PCR產(chǎn)物為平滑末端PCR的反應(yīng)體系4．dNTP:50-200umol/L5.模板DNA（1）單鏈DNA（2）雙鏈DNA（3）濃度：基因組DNA：1ug質(zhì)粒DNA：10ng三、基本操作步驟1.變性(denature):95℃高溫下,雙螺旋氫鍵斷裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA2.退火(annealing):兩條引物與模板DNA擴(kuò)增區(qū)域的兩端按堿基互補(bǔ)配對結(jié)合.3.延伸(extension):在4種dNTP底物及Mg2+存在條件下,TaqDNA聚合酶在72℃下,將單核苷酸按堿基互補(bǔ)配對原則從引物3‘端摻入,,使引物

5、沿5’→3’方向延伸合成新股DNA四、條件優(yōu)化1.變性:95℃變性20-30s,即可使各種DNA完全變性。2.退火:引物與模板退火溫度由引物長度和GC%決定,退火溫度一般應(yīng)比Tm值低4-12℃為宜,退火時間一般為20-40s。3.延伸:通常68-75℃。延伸時間取決于擴(kuò)增片斷的長度.可以500bp/30s為基準(zhǔn)，根據(jù)目的片斷的長度計算反應(yīng)時間。4.循環(huán)次數(shù)：一般為25-35次。PCR反應(yīng)液PCRBuffer（Mg2+）2.5μldNTP混合物（各2.5mM）4μl模板DNA1μl引物1（20uM）0.5μl引物2（20uM

6、）0.5μlTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25μlddH2O至25μlPCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min72℃10min4℃forever五、PCR引物的設(shè)計PCR反應(yīng)成功的一個關(guān)鍵條件是正確設(shè)計引物PCR引物設(shè)計目的是在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩個目標(biāo)上取得平衡.可以利用計算機(jī)軟件進(jìn)行引物設(shè)計,引物設(shè)計軟件會通過每一引物設(shè)計變化的預(yù)定值在兩個目標(biāo)間取得平衡,找出最佳引物.有時也需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.引物設(shè)計的基本原則(一)引物長度在16-

7、30bp范圍內(nèi),以18-24bp為最佳.引物過短,產(chǎn)物特異性降低,每增加一個核苷酸,引物特異性可增加4倍.引物的長度是指與模板DNA序列互補(bǔ)的部分,不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點(diǎn)與額外序列.引物設(shè)計的基本原則(二)引物末端1.引物的3’末端對于PCR反應(yīng)是關(guān)鍵.2.引物的3’末端的第一和第二個堿基影響TaqDNA聚合酶的延伸效率,故其影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性.引物3’末端最佳堿基選擇G或C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定。引物設(shè)計的基本原則3.引物5’末端的堿基無嚴(yán)格限制當(dāng)引物的長度足夠時,引物5’末端的堿基可不與

8、模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)?？稍?’端加上限制內(nèi)切酶位點(diǎn),啟動子序列或其他序列等,以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆。引物設(shè)計的基本原則4.在一個PCR反應(yīng)中的一對引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,特別是3’末端應(yīng)盡量避免互補(bǔ),以免形成“引物二聚體”造成引物浪費(fèi)和非特異性的擴(kuò)增.5.每個引物的內(nèi)部應(yīng)盡量避免形成二級結(jié)構(gòu)