細(xì)胞核的分離純化

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1、細(xì)胞核的分離純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、初步掌握細(xì)胞核分離純化及核酸定量測定的原理與方法。2、通過本次實(shí)驗(yàn)，結(jié)合以前學(xué)過的其它生化技術(shù)，初步了解亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離、提純、鑒定和細(xì)胞內(nèi)成分的定量測定的一般方法。3、熟練掌握普通離心機(jī)的使用，在此基礎(chǔ)上了解高速、超速離心技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、小鼠肝勻漿的制備。2、細(xì)胞核的分離與純化。3、RNA的測定。4、DNA的測定。三、實(shí)驗(yàn)原理1、分離原理：在研究細(xì)胞內(nèi)各部位的結(jié)構(gòu)與功能，及各細(xì)胞器在細(xì)胞活動(dòng)中所起作用時(shí)必須有一整套完善提取某一細(xì)胞成分的方法，從而進(jìn)行深入研究。以

2、肝細(xì)胞核的提取為例，了解一般分離提取的基本原理和方法，動(dòng)物肝臟用1.5％檸檬酸溶液制成勻漿，經(jīng)離心分離出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核部分再進(jìn)一步在蔗糖檸檬酸溶液中離心純化，可獲得初步純化的白色細(xì)胞核沉淀。2、測定原理細(xì)胞核中核酸組成與細(xì)胞質(zhì)不同，細(xì)胞核內(nèi)含大量DNA，而RNA較少，細(xì)胞質(zhì)中則RNA含量豐富。RNA在堿性溶液中水解后，其核糖部分可被濃酸脫水形成糠醛，后者能和3,5－二羥基甲苯縮合成綠色化合物。DNA在過氯酸溶液中加熱水解后，其脫氧核糖部分在濃酸中生成ω一羥基γ一酮戊醛等化合物，再進(jìn)一步與二苯胺

3、作用，可產(chǎn)生藍(lán)色化合物。四、試劑與器材1、0.25mol/L蔗糖檸檬酸（含3.3mmol/LCaCl）2稱取蔗糖86g及CaCl363mg，用1.5％擰檬酸液溶解并2稀釋至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖檸檬酸液（含3.3mmol/LCaC）2稱取蔗糖301g及CaCl363mg，用1.5％檸檬酸液溶解2并稀釋至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5緩沖液250ml中加NaCl8

4、.7g再用蒸餾水稀釋至1000ml。4、1.5％擰檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、離心機(jī)8、水浴箱9、常規(guī)玻璃儀器五、操作步驟（一）細(xì)胞核的分離1、肝勻漿制備：頸椎脫臼法處死小白鼠，迅速取出肝臟，用生理鹽水洗去血液，除去結(jié)締組織，剪碎。稱取0.5克肝組織，加10倍體積（約5ml）的1.5％檸檬酸溶液在勻漿器中制成勻漿，將勻漿液用雙層紗布過濾，以除去殘?jiān)?、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核：將勻漿液全部傾入離心管中，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，上層液含細(xì)胞質(zhì)，倒于另一試管中保留，待測定核酸

5、。沉淀為粗制的細(xì)胞核，在細(xì)胞核中加入1ml0.25mol/L蔗糖擰檬酸溶液，用玻捧攪勻，成為核懸液。另取離心管一只，加0.88mol/L蔗糖-檸檬酸液9ml，用滴管吸取上述核懸液，沿管壁緩緩鋪于0.88mol/L蔗糖-檸檬酸溶液液面上，再以2000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，傾去上層液，將管倒立于濾紙上，以吸干余液。此為初步純化的細(xì)胞核。用Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗滌沉淀以2000rpm離心10分鐘，除去上層液。再重復(fù)洗滌一次白色沉淀即為純化的肝細(xì)胞核。加5ml0.02mol/L的NaOH使

6、細(xì)胞核溶解為核液，保留，待測定核酸。（二）核糖核酸的測定1、水解：取離心管二只，編號，按下表操作：編號12細(xì)胞質(zhì)（ml）1.0——核液（ml）——1.0KOH（ml）1.01.0混勻各管，置沸水浴煮沸10分鐘，取出冷卻。加8ml5%三氯醋酸攪勻。使蛋白質(zhì)及DNA沉淀，2000rpm離心5分鐘，其上清液為RNA的堿水解液。2．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作。編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（ml）1.0————核液水解液（ml）——2.0——5％三氯醋酸（ml）1.0——2.03,5一二羥基甲苯液（ml）3.

7、03.03.0立即混勻，沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，比較各管顏色有何不同。（三）脫氧核糖核酸的測定1、水解：取離心管二只，編號，按下表操作：編號12細(xì)胞質(zhì)（ml）2.0——核液（ml）——2.0過氯酸（ml）2.02.0混勻各管，置沸水浴煮沸10分鐘，取出冷卻。2000rpm離心5分鐘，其上清液為DNA的水解液。2．鑒定：取試管三支，編號，按下表操作。編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（ml）2.0————核液水解液（ml）——2.0——過氯酸（ml）2.0——2.0二苯胺（ml）4.04.04.0立即混勻，

8、沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，比較各管顏色有何不同。