GBT18648-2002 非洲豬瘟診斷技術(shù) - 下載地址.pdf

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1、GB/T18648-2002前言非洲豬瘟(Africanswinefever，簡稱ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病其特征為病程短，病死率高，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，表現(xiàn)高熱、皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。為世界動物衛(wèi)生組織[WorldOrganizationforAnimalHealth(英)，OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE]和我國規(guī)定的動物一類疾病。病毒在鮮肉和腌肉中能存活數(shù)月。ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷分為兩類:第一類包括病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的檢測;

2、第二類包括抗體的檢測。試驗(yàn)方法的選擇主要依據(jù)本國或本地區(qū)的疾病情況而定。在沒有ASF但又懷疑該病存在的國家，實(shí)驗(yàn)室診斷必須應(yīng)用無感染性的診斷方法，即應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測病毒基因組DNA和應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清抗體我國是無ASF國家，目前尚無ASF的檢疫方法。農(nóng)業(yè)部動物檢疫所于199?年與美國梅島動物病研究中心進(jìn)行了ASF的無感染性快速檢測方法的合作研究，建立了適合于我國使用的由可疑感染動物血液和內(nèi)臟器官中直接檢測ASFVDNA的PCR技術(shù)，以及檢測血清中ASFV抗體的ELISA方法。本標(biāo)準(zhǔn)對這兩種方法技術(shù)要求作了規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A

3、、附錄B和附錄C都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部動物檢疫所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:蔣正軍、王樹雙、尹燕博、蔡麗娟、郭福生、陸明哲、孫淑芳、龔振華。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/'r18648-2002非洲豬瘟診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAfricanswinefever范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟(ASF)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生豬和野豬等易感動物及其產(chǎn)品ASF的診斷和檢疫。2PCR試驗(yàn)2.1材料準(zhǔn)備2.1.

4、1樣品DNA制備方法見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。2.1.2電泳液緩沖液的配制方法見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)ASFV-BA=株DNA、引物1、引物2,1.25mmol/LdN丁P和載樣緩沖液。2.1.4臺克(Taq)DNA聚合酶、分子量為100堿基對(bp)Ladder(標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker)0和10倍濃度的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增緩沖液。2.1.5自動DNA熱循環(huán)儀。2.2操作方法2.2.1將下列試劑按要求量加人到0.75mL的離心管中:滅菌蒸餾水(24.5風(fēng));10倍濃度的PCR擴(kuò)增緩沖液(5VL);1.25mmol/LdNTP貯存液(8pL);

5、引物1(1pL);引物2(1pL);樣品DNA溶液(10JAI)(見附錄A);TaqDNA聚合酶(。.5PI)。2.2.2設(shè)定兩個對照，陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)的ASFV-BA，株的10pLDNA含量為10fg;陰性對照為不含DNA的滅菌蒸餾水10討。2.2.3取50pl礦物油覆蓋在混合液上。2.2.4將加有樣品或?qū)φ栈旌衔锏腅ppendorf管放人自動DNA熱環(huán)儀中，按下述程序和條件進(jìn)行DNA擴(kuò)增94C5min,50一C2min,72C3min循環(huán)一次;94C1min,50'C'2min,72C3min循環(huán)30次;94C1min,50"C2min,72'C10min循

6、環(huán)一次，最后置于4'C保存。2.2.5上述步驟完成后，從礦物油下小心取出每種反應(yīng)混合物20pL，放人另一支干凈的Eppendorf管中并加2pL載樣緩沖液。2.2.6將所有樣品按編號加人到對應(yīng)2%瓊脂凝膠(見附錄B1)板的各孔中，其中一孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA樣品。在凝膠的邊孔中加人標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAMarker,2.2.7將凝膠在150v恒定電壓下電泳2ha2.2.8結(jié)果判定:用紫外光源檢查凝膠。如為陽性樣品，則出現(xiàn)一條孤立的、與陽性對照PCR產(chǎn)物的同步遷移的帶，分子量為265bp,陰性對照和非ASF感染豬無265by帶。3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3門試劑:標(biāo)

7、準(zhǔn)抗原中華人民共和國國家質(zhì)t監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2002-02-19批準(zhǔn)20D2一05一01實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載Gs/'r18648-20020.1mol/L磷酸鹽緩沖液(制備方法見附錄Cl)，底物溶液(見附錄C2),;.;操作方法3.3.1取EIASA微量滴定板，每孔加人用。Imol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液稀釋至工作滴度的抗原溶液50pL，封板后于4C作用16h(過夜)3.3.2用pH7.2的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗板3次，每次2min,3.3.3用含。.05Y,吐溫一20的。.1mol/I磷酸鹽緩沖液溶液，將待檢血清以及陽性

8、和陰性對照血清作30倍稀釋，將稀釋的血