《水產(chǎn)生物遺傳育種學(xué)》學(xué)生實驗

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1、1.材料與方法1.1實驗材料實驗用魚：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院第二生物試驗室提供，魚已達到性成熟，體質(zhì)量為705go實驗藥晶：鯉?魚卡諾固定液、Giemsa染液、蘇木精染液、低滲液（0.075mol/lKC1溶液）、磷酸緩沖溶液（PH=6.8）、PHA（75%植物血凝素）、秋水仙素（0.3%）、生理鹽水、肝素鈉（500單位/ml）。1?2實驗藥品液體配制1.2.1卡諾固定液的配制：冰醋酸溶液與甲醇溶液以體積比1:3的比例混合，根據(jù)實際用量現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2.2Giemsa染液的配制：稱取Giemsa粉末0.5g加兒滴廿油充分研磨后再加33ml甘油,56°C恒

2、溫水浴1.5~2h,再加33ml甲醇攪拌均勻后,過濾。1.2.3磷酸緩沖溶液（PH=7.8）的配制：稱取Na2HP04?12也0結(jié)晶2.3876g用蒸錨水配制成100ml溶液,另稱取KH2PO4固體粉末0.9078g用蒸憎水配制成100ml溶液,取已配置好的Na2HP04溶液49.0ml與KH2P04溶液51.0ml混合均勻，配制成100mlPH=7.8的磷酸緩沖溶液。1.2.4生理鹽水的配制:分別稱取NaCl、KCl、CaC12固體粉末7.5g、0?35g、0.21g并分別用蒸懈水溶解，Z后均勻混合定容至1000mlo1.2.5蘇木精染液的配制：稱取蘇

3、木精晶體2.0g,溶于少量酒精小，加入冰醋酸100ml后攪拌,充分溶解后加入100ml甘油和95%酒精100ml。稱取KA1S0,5.0g,充分研磨后溶T100ml蒸憎水并加溫，將加溫后的鉀磯溶液一滴滴加入染色劑屮，并不斷攪動，全部溶液加入后，瓶口用雙層紗布包扎，放于通風(fēng)處并經(jīng)常搖動，直到顏色變?yōu)樽霞t。1.3實驗方法1.3.1前處理采用林義浩植物血細胞凝集素（PIIA）體內(nèi)注射法稍作修改⑵，向試驗魚胸腔內(nèi)注射PHA（注射部位胸鰭基部），劑量為5ug/g,注射后給以充足的氧氣暫養(yǎng)24h,再向試驗魚胸腔內(nèi)注射秋水仙索，劑量為2.5ug/g,注射秋水仙索后暫養(yǎng)

4、4ho1.3.2取材抽血后的試驗魚剪腮放血，取魚頭疔于生理鹽水屮清洗2~3遍，除去血塊及其他組織，然后置丁?盛有少量生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用小剪刀充分剪碎，然后用200目的篩絹網(wǎng)過濾分兩組置入離心管中，用吸管吹打5min,靜置片刻，制成細胞懸液。1.3.3低滲處理將1.3.2處理的細胞懸液在1000r/min離心5min后棄去上清液,收集細胞，加入5ml低滲液用吸管吹打均勻，室溫下低滲45mino1.3.4固定低滲后的細胞，打勻后加1?5ml卡諾固定液固定30min,離心1500r/min,5min,棄上清液,加4m］卡諾固定液固定20min,離心，反復(fù)兩

5、次。第3次固定后棄上清液,加少量固定液制成約0.5ml的懸液，低溫下保存過夜。1.3.5滴片滴片前離心1500r/min,5min,加卡諾固定液0.5ml,將細胞吹打均勻。冷滴片：潔凈的載玻片冷凍24h,吸取細胞懸液在45度傾斜的玻片上滴2?3滴，并輕輕吹動，使細胞鋪散開。然后將鋪散細胞的玻片斜放靜置，在酒精燈上過幾次使其干燥（火焰干燥法）。熱滴片：潔凈的載玻片在50°C'

6、?預(yù)熱20min,滴片方法同冷滴片。1.3.6染色Giemsa染液染色：用磷酸鹽緩沖液（PH二7.2）將Giemsa原液按9：1稀釋，配成工作液。取一?塊干凈的玻璃，以略小于玻片長度

7、為間距放置干凈玻片作架，將待染的玻片置于染色的容器內(nèi)，將染液加入，染色30-45min后取出，用自來水沖去染液，用中性樹膠封片，烘干后即可用于觀察分析。蘇木精染液染色：染色前無需對染液做處理，其余過程同Giemsa染液染色過程。1.3.7鏡檢在顯微鏡下進行觀察，統(tǒng)計并拍照。