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1、很好，需要好好研究一下原文地址：畢赤酵母表達(dá)知識(shí)01轉(zhuǎn)載于丁香作者：思時(shí)爾非a.配制500×BIOTINstocksolution（0.02％）有這么3種方案：1、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；2、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加熱，溫度不能高于50度。D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。b.有幾個(gè)比較迷惑的問題請(qǐng)教
2、大家：(很典型的小問題）1、制感受態(tài)細(xì)胞，OD多少比較好？pyrimidine戰(zhàn)友的方法：取1mlGS115過夜培養(yǎng)物(OD約6-10)分裝到1.5mlEP管中。說明書還有一些文獻(xiàn)是說在1.3左右效率高，再高了效率會(huì)很低2、關(guān)于高效轉(zhuǎn)化法，文獻(xiàn)說用(LiAc)，而invitrogen的說明書說轉(zhuǎn)化畢赤酵母用(LiAc)沒用，要用LiCl。LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高溫滅么？有的說能有的說不能。過濾滅菌的怎么操作？我是把濾器裝好膜綁到瓶口用紗
3、布蓋上，報(bào)紙包上，瓶蓋放燒杯里單滅。然后把配好的溶液用注射器一點(diǎn)點(diǎn)推進(jìn)去。4、葡萄糖為什么在YPD里一起滅顏色很深，單滅則不會(huì)。該115度還是121度滅？網(wǎng)上搜了下，都有人用！5、電轉(zhuǎn)化參數(shù)用400歐還是200歐？有的用400，有的還專門說不是用400。都是從園里看到的！電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400）6、電轉(zhuǎn)后，在MD平板上長(zhǎng)的應(yīng)該就是整合了目的基因的重組子了吧？如果不想篩高拷貝的，是否PCR驗(yàn)證一下即可？網(wǎng)友的回答：ynb最好不滅菌，我是0.22um過濾處理的。invitrogen手冊(cè)上可以滅菌的。glucose和含氮化合物在一起容易
4、產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。很好，需要好好研究一下原文地址：畢赤酵母表達(dá)知識(shí)01轉(zhuǎn)載于丁香作者：思時(shí)爾非a.配制500×BIOTINstocksolution（0.02％）有這么3種方案：1、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；2、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加熱，溫度不能高于50度。D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的
5、生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。b.有幾個(gè)比較迷惑的問題請(qǐng)教大家：(很典型的小問題）1、制感受態(tài)細(xì)胞，OD多少比較好？pyrimidine戰(zhàn)友的方法：取1mlGS115過夜培養(yǎng)物(OD約6-10)分裝到1.5mlEP管中。說明書還有一些文獻(xiàn)是說在1.3左右效率高，再高了效率會(huì)很低2、關(guān)于高效轉(zhuǎn)化法，文獻(xiàn)說用(LiAc)，而invitrogen的說明書說轉(zhuǎn)化畢赤酵母用(LiAc)沒用，要用LiCl。LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高溫滅么
6、？有的說能有的說不能。過濾滅菌的怎么操作？我是把濾器裝好膜綁到瓶口用紗布蓋上，報(bào)紙包上，瓶蓋放燒杯里單滅。然后把配好的溶液用注射器一點(diǎn)點(diǎn)推進(jìn)去。4、葡萄糖為什么在YPD里一起滅顏色很深，單滅則不會(huì)。該115度還是121度滅？網(wǎng)上搜了下，都有人用！5、電轉(zhuǎn)化參數(shù)用400歐還是200歐？有的用400，有的還專門說不是用400。都是從園里看到的！電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400）6、電轉(zhuǎn)后，在MD平板上長(zhǎng)的應(yīng)該就是整合了目的基因的重組子了吧？如果不想篩高拷貝的，是否PCR驗(yàn)證一下即可？網(wǎng)友的回答：ynb最好不滅菌，我是0.22um過濾處理的。in
7、vitrogen手冊(cè)上可以滅菌的。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。想請(qǐng)教下關(guān)于菌種保存的方法。我現(xiàn)在是采用斜面保存的方法，但感覺每次接菌都要打開斜面，而且每次的接菌量難免會(huì)有不少的誤差，所以很想問一下大家都是怎么保存菌種的，特別是甘油菌的保存方法。我一般吸取300ul的菌液到滅菌的ＥＰ管然后加等體積的甘油，混勻．防于－２０度．保存長(zhǎng)的話最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，過夜菌在篩選高表達(dá)菌種中，我一般有一下步驟，很很多人做的不太一樣，和說明書也有點(diǎn)差異，如下：每次轉(zhuǎn)化前，均用多種酶切，B
8、lgII/salI/sa
