華科生化教案

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1、實(shí)驗(yàn)一還原糖和總糖的測(cè)定（3,5--硝基水楊酸比色法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理2、學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用二.實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有口由醛基或酮基的糖類。單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，例如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用各種糖的溶解度不同，可將植物樣晶中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來。對(duì)非還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成還原性單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（常以葡萄糖含量計(jì)）0還原糖在堿性條件下加熱可被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，而氧化劑

2、3,5-二硝基水楊酸則被還原為桔紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與桔紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)在540mn波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖甘鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以系數(shù)0.9[=6（162n+18）/180n](DNS)加熱+還原糖”堿性（3—氨基一5—硝基水楊酸）黃色桔紅色三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器1、實(shí)驗(yàn)材料面粉；lmg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑；碘-碘化鉀溶液；酚駄指示劑；6mo1/LHC1；6mol/LNa

3、OH；2mol/LNaOHo2、實(shí)驗(yàn)儀器試管：15mniX180niniX12；燒杯：100mLX6,SOOmLXl,錐形瓶：lOOmLXl；容量瓶：100mLX3,25mLX1;吸量管：10mLX3,2mLX3,lmLX3；恒溫水浴鍋;900mL燒杯(或不銹鋼杯子)XI；載玻片；玻璃棒；膠頭滴管；分光光度計(jì)；漏斗；濾紙；試管架；擦鏡紙；電子秤等。四、實(shí)驗(yàn)過程1?樣品溶液制作(1)還原糖的提取用lOOmL燒杯準(zhǔn)確稱取0.65g面粉，先用少量蒸憎水調(diào)成糊狀，然后加入15mL蒸倔水，攪勻，置50°C恒溫水中保溫20min,并不斷攪拌，使還原糖浸出。過濾，將濾液全部收集在2

4、5mL容量瓶中，用蒸謂水定容至刻度線，作為還原糖待測(cè)液。(2)總糖的水解和提取用lOOmL錐形瓶準(zhǔn)確稱取0.5g面粉，加15mL蒸憾水及10mL6mol/L鹽酸，置沸水浴中加熱水解30min,吸出一滴滴在載玻片上，用碘-碘化鉀溶液檢查水解是否完全，若溶液不變藍(lán)色說明水解完全。待錐形瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚駄指示劑，用611101/LNaOH溶液中和，接近滴定終點(diǎn)時(shí)改用2mol/LNaOH溶液中和至微紅色，用蒸謂水定容在lOOmL容量瓶中。過濾，収濾液lOmL,移入100mL容量瓶中定容，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測(cè)定。2.制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中

5、還原糖和總糖的測(cè)定取12支15mmX180mm試管編號(hào)，按下表分別加入濃度為1.Omg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、樣品溶液、蒸憎水和DNS試劑，配成不同濃度的反應(yīng)液。根據(jù)0-9號(hào)管測(cè)定的數(shù)據(jù)，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣晶的吸光度在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。試劑管號(hào)0123456789還原糖總糖葡勰標(biāo)準(zhǔn)液(mL)0.00.20.40.50.60.70.81.01.21.4//樣品溶液(mL)//////////1.51.5蒸憎水(mL)2.01.81.61.51.41.31.21.00.80.60.50.5DNS(mL)

6、1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量(mg)0.00.20.40.50.60.70.81.01.21.4//將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫,再向每管加入16.5mL蒸館水，搖勻。在入=540nm處測(cè)定吸光度，注意用0號(hào)管調(diào)零。A=540處測(cè)定吸光度五、結(jié)果與計(jì)算按下式計(jì)算岀樣品屮述原糖和總糖的白分含量:、才嚴(yán)也皿mix25^-1.5.cc還原糖％=xlOO加2x1000總糖％二"上1?5%稀釋倍數(shù)X0.9X100m2x1000式屮，叫為根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)1川線屮查出的還原糖或總糖的含量(m

7、g)；m2為樣品重量；1000為mg換算成g系數(shù)。六、注意事項(xiàng)1.在稱取面粉時(shí)，注意量程，燒杯、錐形瓶等不可用小量程天平稱量。2.在還原糖提取步驟中的定容過程中，應(yīng)沿壁緩慢加入蒸懾水，否則可能會(huì)使液面上產(chǎn)生人量氣泡導(dǎo)致不易定容。3.在檢查水解是否完全時(shí)，注意不要吸取過多總糖提取液，以致最終結(jié)果小。4.使用分光光度計(jì)之前要預(yù)熱10-20mino5.試管沸水浴后應(yīng)先用流水沖洗再放入大燒杯中進(jìn)行冷卻，避免因溫度變化劇烈而導(dǎo)致試管炸裂。［思考題］1、在樣品的總糖提取時(shí)，為什么要用濃HC1處理？而在其測(cè)定前，又為何要用NaOH屮和？2、在X=540nm處測(cè)定吸