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《酵母SOD分離純化及其酶學性質(zhì)的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、收稿日期:2004-6-16作者簡介:蘇昕(1966-),女(漢族),遼寧沈陽人,講師,碩士,主要從事微生物與生化藥學研究,Tel.024-23843711-3513,E-mailsuxin660511@sina.com。文章編號:1006-2858(2005)01-0067-04酵母SOD分離純化及其酶學性質(zhì)的研究蘇昕,閻浩林,梁麗莉(沈陽藥科大學制藥工程學院,遼寧沈陽110016)摘要:目的發(fā)酵培養(yǎng)Y12酵母菌分離制備酵母SOD并研究其部分酶學性質(zhì)。方法用已篩選出的一株Y12酵母菌對其在優(yōu)化培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)得到濕菌體,破壁抽提得SOD粗酶液,采用硫銨鹽析、丙酮沉淀、Sepha
2、dexG-100凝膠過濾和QAE-SephadexA-50離子交換柱層析,分離得到酵母SOD并測定其部分酶學性質(zhì)。結(jié)果Y12酵母菌SOD產(chǎn)量達1263u#g-1濕菌體,分離得到酵母SOD,該酶屬Cu、Zn-SOD,比活力為107315u#mg-1,活力回收率為5411%,紫外吸收峰在25712nm,分子質(zhì)量為32456u,亞基分子質(zhì)量為16227u。結(jié)論此酵母SOD與文獻中報道的動物血紅細胞Cu、Zn-SOD基本相近。關鍵詞:酵母SOD;分離純化;酶學性質(zhì)中圖分類號:Q554文獻標識碼:A超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)是一種含有銅、鋅、鐵、錳的新型
3、金屬酶,1969年由Mccord和Fridovich發(fā)現(xiàn)其能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應而命名[1]。SOD是機體內(nèi)的唯一以超氧陰離子為底物的酶,能維持細胞內(nèi)氧自由基處于無害低水平狀態(tài),是進行需氧代謝的生物維持生存所必需的酶。由于SOD廣泛存在于生物界,能專一清除超氧陰離子自由基,已引起國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界的極大關注。近年來,國外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的相關報道很多[2]。其中發(fā)酵法生產(chǎn)SOD是一條經(jīng)濟可行的途經(jīng)[3]。酵母菌作為生產(chǎn)SOD的材料來源之一,具有繁殖快,代謝時間短,產(chǎn)率高,易培養(yǎng),易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),不受季節(jié)與自然條件的限制等優(yōu)點。故作者以酵母菌作為實驗材料,
4、探索出一種發(fā)酵法制備SOD的途徑,為今后生產(chǎn)奠定必要的技術基礎。1材料與儀器111菌種酵母Y12(本實驗組經(jīng)粗篩得到的高產(chǎn)菌株,中國科學院沈陽生態(tài)所微生物菌種保藏室提供)。112培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基:8bBe麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基;優(yōu)化培養(yǎng)基(液體種子及發(fā)酵用):酵母膏1g、蔗糖2g、酒石酸銨2g、Fe3+(0101mol#L-1)1mL、8bBe麥芽汁5mL,溶于100mL蒸餾水中,調(diào)pH值為5,115e滅菌20min。113藥品鄰苯三酚(分析純,浙江省溫州市甌海精細化工公司),QAE-SephadexA-50(瑞典Pharmacia進口分裝,上?；瘜W試劑采購供應站試劑廠),Sephdex
5、G-100(瑞典Pharmacia進口分裝),牛血清白蛋白(上海麗珠東風生物技術有限公司),低分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)(分子質(zhì)量14400~97400u,中國科學院上海生物化學研究所監(jiān)制),標準SOD酶(3000units,美國Sigma公司),其他試劑均為分析純。114儀器PHS)2B型數(shù)字酸度計(上海雷磁儀器廠),HZQ)CHYA恒溫搖瓶機(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司),UV)9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司),DYY)ó2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(配有垂直板型電泳槽,北京市六一儀器廠),GL)16G)ò冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。2方法與結(jié)果211菌種部分菌種酵母
6、Y12經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化2次,每次培養(yǎng)48h,轉(zhuǎn)入優(yōu)化種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15h,再轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)15h,溫度均為28e,第22卷第1期2005年1月沈陽藥科大學學報JournalofShenyangPharmaceuticalUniversityVol122No11Jan.2005p167對發(fā)酵液離心4000r#min-1,20min得濕菌體,水洗2次后稱量,得到濕菌體量為每瓶30mL發(fā)酵液115g,菌體經(jīng)超聲波法破壁得粗酶液[4],酶活力為126310u#g-1濕菌體。212Y12酵母SOD酶的分離純化由/2110條的粗酶液經(jīng)硫胺鹽析(017倍飽和度,12000r#min-
7、1離心10min),丙酮沉淀(018倍丙酮,12000r#min-1離心10min),得SOD樣品,用5mL蒸餾水溶解后,經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾柱層析。層析柱:116cm@90cm;洗脫液:蒸餾水;流速:0125mL#min-1;每管3mL。整個柱層析實驗在低溫實驗室中操作,經(jīng)對收集的每管進行酶活力測定[5](酶活力單位定義:在1mL反應液中,將每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量,定為一個酶活力單位,即325nm01030OD#min-1為一個活
