質(zhì)粒DNA的提取

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1、§2質(zhì)粒DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)通過質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械脑噭?duì)大腸桿菌中的重組質(zhì)粒pET22b的抽提，掌握質(zhì)粒DNA的小量制備方法，了解堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理載體是基因工程所必需的工具，它用于將目的基因運(yùn)載到宿主細(xì)胞內(nèi)的克隆與表達(dá)。自然界的質(zhì)粒經(jīng)改造以后，常被用作基因工程技術(shù)的基因載體。常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA和昆蟲病毒DNA等，而質(zhì)粒是最常用的載體。細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外，能夠獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀DNA。質(zhì)粒DNA小量制備是基因工程操作中的常規(guī)技術(shù)，提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切、連接與轉(zhuǎn)化等。從大

2、腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其分離可依據(jù)并選擇利用DNA分子大小不同，堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)來進(jìn)行。常用的有堿變性抽提法，羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法，兩相法以及溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心法。以上各種方法均有利弊，因此在制備質(zhì)粒DNA時(shí)，要根據(jù)以下幾個(gè)方面進(jìn)行比較，選擇最佳的實(shí)驗(yàn)方法：（1）質(zhì)粒特性：如質(zhì)粒宿主的菌屬，是否需要用溶菌措施。質(zhì)粒DNA的大小，分子量大的在制備過程中易受損傷，DNA易產(chǎn)生缺口；拷貝數(shù)、構(gòu)型、復(fù)制型是否需要氯霉素?cái)U(kuò)增等。（2）提取質(zhì)粒DNA的用量與用途：如用于初篩比較分子量大

3、小、進(jìn)行酶切、作探針或測(cè)序等。（3）提取方法的成本、程序、重復(fù)性、純度以及實(shí)驗(yàn)室具備的條件等。目前實(shí)驗(yàn)室中最常用、最有效的方法為堿變性抽提法和溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心法兩種。堿變性抽提法效果良好，既經(jīng)濟(jì)且收得率較高。提取到的質(zhì)粒DNA可用于酶切、連接與轉(zhuǎn)化。但該法如操作不慎，會(huì)影響純度，且步驟復(fù)雜，費(fèi)時(shí)較多。對(duì)于分子量較大拷貝較少的質(zhì)粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用氯化銫密度梯度超離心法抽提DNA，該法具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定且獲得的質(zhì)粒DNA是超螺旋構(gòu)型等特點(diǎn)。對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，用小量制備法抽提質(zhì)粒DNA就有足夠量可用于后續(xù)的操

4、作。本試劑盒是由上海申能博采試劑公司提供的，其原理是采用堿裂解——中和法。該法抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在pH高達(dá)12.6的條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但它的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，存在于溶液中。而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀而被除去。再進(jìn)一步利用酚，氯

5、仿這兩種蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白雜質(zhì)，用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，得到純化的質(zhì)粒DNA。采用堿裂解——中和法，應(yīng)用常規(guī)臺(tái)式高速離心機(jī)，經(jīng)反應(yīng)條件最優(yōu)化后，使含有質(zhì)粒DNA的上清通過設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)時(shí)，被特殊硅基質(zhì)材料高效、專一地吸附。被吸附的質(zhì)粒DNA隨后可用洗脫緩沖液從離心吸附柱上洗脫下來，本試劑盒有以下特點(diǎn)：（1）快速方便——半小時(shí)完成一次實(shí)驗(yàn)，并能在一小時(shí)左右，同時(shí)處理10-20個(gè)質(zhì)粒樣本，操作簡(jiǎn)便。（2）高效優(yōu)質(zhì)——省略苯酚、氯仿的抽提，減少了對(duì)質(zhì)粒DNA的破壞。從2-3ml菌液可提取出約15-20μg質(zhì)粒DNA，其中超螺旋結(jié)構(gòu)占90%以上，并

6、且也無蛋白質(zhì)、鹽類、有機(jī)化合物的污染，可用作測(cè)序模板和其它酶促反應(yīng)。三、儀器和試劑（一）儀器：高速離心機(jī)、螺旋混合器、冰盒、計(jì)時(shí)器、1.5mlEppendorf離心管。（二）試劑：已培養(yǎng)的菌液、質(zhì)?？焖偬崛『校ㄉ虾Ｉ昴懿┎试噭┕荆o水乙醇。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）準(zhǔn)備工作：1.試劑公司將質(zhì)?？焖偬崛『兴偷綄?shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即將已加RnaseA的Solution1置于4℃冰箱保存。2.Solution2及Solution3如有白色沉淀、高鹽結(jié)晶析出，請(qǐng)將瓶蓋擰松后置于微波爐連續(xù)加熱10-15秒，或37℃以下保溫溶解，搖勻后使用。確保每使用完一種試劑后，立即蓋緊該試

7、劑瓶的瓶蓋。3．使用前，必須在22mlWashSolution瓶中加入50ml無水乙醇，充分混勻后使用，或按WashSolution：無水乙醇為11：25的比例，用多少配多少。（二）實(shí)驗(yàn)步驟：1．收集1.5-3ml菌液于1.5mlEppendorf離心管中，12000rpm離心1min，徹底棄去上清，管底保留沉淀菌體。如果菌體量太少，可再重復(fù)收集一次。2．加入100μlSolution1，用移液器或振蕩器徹底懸浮細(xì)菌。注意：（1）為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)細(xì)菌的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般為12個(gè)小時(shí)。如果是高拷貝質(zhì)粒，1.5ml細(xì)菌將獲得足夠的DNA，對(duì)于低

8、拷貝數(shù)的質(zhì)粒，用5ml細(xì)菌；質(zhì)粒如果用于全自動(dòng)熒光測(cè)序，用5ml細(xì)