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1、CHAPTER5植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞雜交第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）第三節(jié)以原生質(zhì)體做受體的遺傳轉(zhuǎn)化第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體的概念：植物細(xì)胞原生質(zhì)體（protoplast）一詞始于Hanstein（1880），在植物學(xué)上它是指植物細(xì)胞通過質(zhì)壁分離后可以和細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用：1植物育種2打破有性雜交的局限（自由雜交局限、減數(shù)分裂局限、胞質(zhì)基因局限）進(jìn)行育種3遺傳轉(zhuǎn)化4避免細(xì)胞壁上核酸酶對(duì)外源基因的破壞5利用原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)6理論研究細(xì)胞起源、細(xì)胞壁再生、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能、核質(zhì)關(guān)系、胞間作用、激素作
2、用機(jī)理等。一植物原生質(zhì)體研究歷史與現(xiàn)狀1、機(jī)械法分離原生質(zhì)體時(shí)期1892年由Klercker用于從質(zhì)壁分離的Stratiotesaloides細(xì)胞分離原生質(zhì)體；隨后為Chambers和Hofler（1931）將洋蔥表皮組織的薄片浸在1.0mol/L蔗糖溶液中，當(dāng)原生質(zhì)體收縮脫離壁時(shí)用快的刀片切開表皮細(xì)胞，獲得了少量表皮細(xì)胞的原生質(zhì)體。2、酶法制備原生質(zhì)體階段1960年英國Nottingham大學(xué)植物學(xué)系Cocking首次用纖維素酶從番茄幼苗的根分離得到原生質(zhì)體，從此開創(chuàng)了用酶法分離植物原生質(zhì)體的時(shí)期。其后纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶的商品化，使得實(shí)驗(yàn)室
3、制備原生質(zhì)體成為一中常規(guī)技術(shù)。二、植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展1、分離方法的改進(jìn)：商品酶的出現(xiàn)，從各類植物以及不同的器官、組織，都成功地分離到原生質(zhì)體。2、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟：培養(yǎng)基、培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)極大地提高了培養(yǎng)的效率。現(xiàn)在常用的瓊脂糖包埋培養(yǎng)（包括瓊脂糖塊周圍加液體培養(yǎng)基的方法）、液體淺層培養(yǎng)、使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等技術(shù)，以及發(fā)展出來的一些專門實(shí)用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基如KM8p、V—KM、D2a等的廣泛使用，均極大改善了培養(yǎng)效率。3、性細(xì)胞原生質(zhì)體研究：花粉原生質(zhì)體、精子和生殖細(xì)胞、胚囊及其組成細(xì)胞分離成功；單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)成功，使人們可以嘗試
4、在離體條件下對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行操作，發(fā)展了雌雄配子的融合技術(shù)；培養(yǎng)小麥和大麥的受精卵形成的原生質(zhì)體發(fā)育形成完整植株；利用花粉四分體原生質(zhì)體與體細(xì)胞原生質(zhì)體融合獲得三倍體雜種植株等。4、原生質(zhì)體遺傳操作：利用原生質(zhì)體導(dǎo)入外源DNA獲得轉(zhuǎn)化植物，在多種植物中獲得成功，已由大豆、杠豆、柑橘、多種蕓薹屬植物、水稻、高粱、玉米、小麥等作物獲得轉(zhuǎn)基因植物；建立起有效的葉綠體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)系統(tǒng)；植物病毒在原生質(zhì)體中增殖系統(tǒng)等。三、植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)一）、原生質(zhì)體的分離機(jī)械法酶法影響原生質(zhì)體分離質(zhì)量因素：酶的種類及其組合、酶液的滲透壓、原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間與溫度、分
5、離與純化的方法等。1、材料的選擇：要獲得產(chǎn)量高，質(zhì)量好且容易分裂的原生質(zhì)體，就要注意用于制備原生質(zhì)體的起始材料的特性和生理狀態(tài)。茄科植物一般選擇生長旺盛、生理狀態(tài)一致的剛展開的幼嫩葉片分離原生質(zhì)體。十字花科植物，一般認(rèn)為是從種子萌發(fā)4～5天的無菌苗下胚軸分離原生質(zhì)體，得率高、活力強(qiáng)、再生頻率高。豆科用未成熟種子胚的子葉較好。對(duì)禾本科植物，從幼胚、幼穗、花藥或成熟胚建立胚性愈傷組織及其胚性懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體有利于其后的再生。2、酶制劑：植物的細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)構(gòu)成。一般而言，纖維素約占細(xì)胞壁干重的25%～50%不等。半纖維素約占細(xì)胞
6、壁干重的53%左右，果膠質(zhì)一般約占細(xì)胞壁的5%左右。雙子葉植物的葉片，需用纖維素酶和少量果膠酶愈傷組織細(xì)胞及其懸浮細(xì)胞除用纖維素酶外，還需用較多的果膠酶，有些材料還需加入半纖維素酶。花粉小孢子壁除含有纖維素、果膠質(zhì)外，還有胼胝質(zhì)，分解時(shí)需用蝸牛酶或胼胝質(zhì)酶。3、滲透壓的穩(wěn)定劑：酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)和原生質(zhì)體內(nèi)的相同或接近，滲透壓略大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定，過大會(huì)使原生質(zhì)體收縮并阻礙原生質(zhì)體的啟動(dòng)分裂。廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑使甘露醇和山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，其濃度約在0.4～0.6mol/L。加入CaCl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸鉀都可以
7、提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，增加完整的原生質(zhì)體數(shù)目和活力。葡聚糖硫酸鉀是通過降低酶液中核糖核酸酶活性，而有利于原生質(zhì)膜的穩(wěn)定。4、酶解處理酶解植物材料處理：表面滅菌，材料分割。酶的用量：植物材料應(yīng)按比例和酶液混合才能有效地分離原生質(zhì)體，一般葉片、子葉切條和下胚軸切片需酶量少，而胚性愈傷組織和胚性懸浮細(xì)胞則用酶量大。滲透劑的選擇：小麥和水稻胚性懸浮細(xì)胞，用葡萄糖作滲透劑優(yōu)于甘露醇酶解條件：PH值，時(shí)間，溫度。5、原生質(zhì)體的純化沉降法：用過濾和離心相結(jié)合的方法。漂浮法：采用較原生質(zhì)體比重大、滲透壓高的溶液，使原生質(zhì)體浮于溶液的表面的，這種方法可以收集較純的原生質(zhì)
8、體，但原生質(zhì)體數(shù)量上損失較多，也往往因采用高滲溶液而對(duì)原生質(zhì)體有害。界面法：利用兩種比重不同的
