植物基因槍法轉(zhuǎn)基因技術(shù)

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1、基因工程隨堂作業(yè)題目：植物基因槍法轉(zhuǎn)基因技術(shù)院（系）：專業(yè)：班級：姓名：學(xué)號：成績：完成日期：4植物基因槍法轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將一個或更多的目的基因?qū)胧荏w中,使該基因在受體生物中得以表達。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展,20世紀80年代末,一項新的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)---基因槍技術(shù)應(yīng)運而生。由于基因槍技術(shù)安全性好、效率高,其應(yīng)用范圍迅速從植物基因工程、動物基因工程擴大到基因治療和基因免疫領(lǐng)域,使細胞的研究發(fā)展到在體操作。目前,已有基于基因槍技術(shù)的多種基因疫苗進入臨床研究階段。1.基因槍技術(shù)的轉(zhuǎn)化原理及操作用包裹DNA的金屬小顆粒轟擊受體

2、組織,使DNA實現(xiàn)穿壁并被導(dǎo)入眾多細胞中,稱為“基因槍法”(或微粒轟擊技術(shù))。包裹著DNA的金屬粒加速到一個很高的速度后(通常需要部分真空以減少顆粒的速度損失)穿透受體組織,一般可以穿透2,3層細胞。最初是利用爆炸力在槍管里推動一個大的塑料微粒載片,片上放有包裹著DNA的微粒懸液,后來用一個中間有洞的板擋住高速運動的載片,載片上的微粒穿過洞進入裝有受體組織的真空腔中,并且打入或者穿過運動路徑上的目標組織,微粒上攜帶的外源DNA分子就可能進入細胞,并進行表達?；驑尭鶕?jù)驅(qū)動力可以分為3種基本類型。(1)火藥式基因槍是最原始的類型,由美國

3、康乃爾大學(xué)Sanford等人于1987設(shè)計制造。這種基因槍自使用以來已先后將外源基因?qū)氲接衩住⑿←満退镜榷喾N植物材料中,獲得了瞬間的或穩(wěn)定的表達。它的主體由滑膛腔、真空轟擊室和阻彈部件構(gòu)成。塑料子彈的前端載有大量攜帶了外源目的基因的微彈,當樣品爆炸時,子彈帶著微彈向下高速運動,至阻擋板時子彈被阻礙,其前端的微彈依靠慣性繼續(xù)高速運動,擊中轟擊室的靶細胞。該裝置的特點是,粒子速度主要通過貨樣的數(shù)量及速度調(diào)節(jié)器控制,不能無級調(diào)控,可控程度低。(2)壓縮氣體型基因槍的動力系統(tǒng)以氦氣、氮氣和二氧化碳氣驅(qū)動。一種方法是把載有外源目的基因的微彈

4、懸滴在一張金屬篩網(wǎng)上,在高壓氣體的沖擊下,射入受體靶細胞;另一種方法是把外源目的基因與微彈混合后霧化,再由高壓氣體驅(qū)動射入受體靶細胞,這種系統(tǒng)的靶范圍可精確控制到0。15mm左右。(3)高壓放電型基因槍利用電加速器通過高壓放電將微彈射入受體靶細胞,其特點是可無級調(diào)控,通過調(diào)節(jié)放電電壓來控制粒子的速度和入射速度。2.基因槍技術(shù)的應(yīng)用最早應(yīng)用基因槍進行基因轉(zhuǎn)化并獲得成功的是Klein等人,他們用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮的細胞,并獲得了成功。后來McCabe將目的基因包于鎢粉上,電轟擊大豆莖尖分生組織,結(jié)果約有2j的組織通過器官發(fā)生途徑獲得再生植

5、株,在子代中檢測到了外源基因。1989年用氣動式基因槍轉(zhuǎn)化煙草等植物獲得成功,且得到了瞬時表達。大麥的轉(zhuǎn)基因技術(shù)與其他植物相比發(fā)展較慢,Kartha等用大麥的細胞和組織進行培養(yǎng),檢測到報告基因的瞬時表達?；驑尲夹g(shù)還在禾谷類作物中得到廣泛應(yīng)用,克服了單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化受農(nóng)桿菌寄主限制的局限性。GordonKamm等用基因槍技術(shù)將GUS報告基因和PAT選擇性基因?qū)牖蛐蜑锳188iB73的玉米胚性懸浮細胞系,首次獲得轉(zhuǎn)基因玉米的可育植株,4使轉(zhuǎn)基因玉米技術(shù)受到很大的關(guān)注。賈柿榮等用國產(chǎn)火藥式基因槍實現(xiàn)了質(zhì)粒pBH21對玉米花粉的轉(zhuǎn)化

6、,經(jīng)人工授粉,獲得了轉(zhuǎn)基因植株?；驑尫ú粌H可用于直接轟擊懸浮細胞系和花粉,還可以用來轟擊單個細胞。Rasmussen等利用氦動基因槍,用含質(zhì)粒pBC-17或PBAR-GUS的完整大腸桿菌DH5-和含質(zhì)粒pNY的根瘤農(nóng)桿菌A208轟擊玉米細胞,獲得數(shù)個瞬間轉(zhuǎn)化體,其中有6個是穩(wěn)定的?；驑尲夹g(shù)在對水稻進行基因轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中也獲得了成功。Oard首先應(yīng)用該技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻的愈傷組織,檢測到了GUS基因的瞬時表達。同年,Cao用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化水稻成熟胚,成功獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。小麥是栽培面積最大的重要糧食作物,但卻是最后一個獲得轉(zhuǎn)化成

7、功的禾谷類作物。Vasil等首次報道用基因槍技術(shù)將GUS基因和Bar基因轉(zhuǎn)入長期培養(yǎng)的小麥胚性愈傷組織中。3.基因槍技術(shù)的優(yōu)缺點3.1基因槍技術(shù)的優(yōu)點是:(1)無宿主限制,能轉(zhuǎn)化任何植物,特別是那些由原生質(zhì)體再生植株較為困難和農(nóng)桿菌感染不敏感的單子葉植物,提高了禾谷類植物的轉(zhuǎn)化效率。(2)靶受體類型廣泛,不受基因型的限制,適用于不同的物種以及同一物種的不同品種,能轉(zhuǎn)化植物的任何組織或細胞。(3)可以轉(zhuǎn)化線粒體、葉綠體等植物的不同細胞器。外源DNA進入細胞質(zhì)后很難穿過雙層膜在細胞器,用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化這類細胞器,轉(zhuǎn)化頻率高,重復(fù)性好,是目

8、前該領(lǐng)域研究中最常用和最有效的DNA導(dǎo)入技術(shù)。(4)可以快速獲得第一代種子,方法簡便易行?；驑屴D(zhuǎn)化法在無菌條件下用載有外源基因的金屬顆粒轟擊受體材料,便可以進行篩選培養(yǎng),不需要進行原生質(zhì)體的制備分離與培養(yǎng)的繁瑣工作。(