免疫原和抗血清制備技術(shù)

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1、免疫原和抗血清制備技術(shù)第一節(jié)免疫原的制備第二節(jié)免疫血清的制備第三節(jié)抗體的純化和鑒定第一節(jié)免疫原的制備一、細(xì)胞性抗原的制備二、可溶性抗原制備及鑒定三、半抗原免疫原的制備四、佐劑綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖搖動(dòng)15-20min4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%細(xì)菌細(xì)胞抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)37℃24h100℃水浴2～2.5h殺菌無菌試驗(yàn)NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原返回來源:組織和細(xì)胞，其成分比較復(fù)雜。1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備2.蛋白質(zhì)抗原制備3.核酸抗原制備4.類脂多糖抗原制備5.免疫球蛋白片段制備6.純化

2、抗原的鑒定二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制備及鑒定返回組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序上清液澄清所用材料必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結(jié)締組織臟器進(jìn)行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN2冷浴中組織剪碎裝入搗碎機(jī)簡(jiǎn)內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液3000r／min×10min取上清液去除細(xì)胞碎片及微小組織離心細(xì)胞破碎技術(shù)及評(píng)價(jià)1.酶處理法2.凍融法3.超聲破碎法4.表面活性劑處理細(xì)胞破碎技術(shù)及評(píng)價(jià)常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等1.酶處理法1.酶處理法方法：在一定的條件下，能消化細(xì)菌

3、和組織細(xì)胞。特點(diǎn)：①此法適用多種微生物；②具有作用條件溫和；③內(nèi)含物成分不易受到破壞；④細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。2.凍融法原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。2.凍融法完方法：將待破碎的細(xì)胞置冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后緩慢融化，如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。3.超聲破碎法原理：利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞破碎。由于超聲波發(fā)生空化作用（cavitation）使得液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流動(dòng)，漩渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力，使細(xì)胞破碎。超聲波使用的頻率從1kHz～

4、20kHz不等，間歇進(jìn)行，避免長(zhǎng)期超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。3.超聲破碎法特點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；②多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。4.表面活性劑處理原理：在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。4.表面活性劑處理常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。應(yīng)用：①破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；②提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。蛋白質(zhì)抗原制備蛋白質(zhì)是良好的抗原，要制備特異性高的抗血清通常需要純化?？刹捎茫?.超速離心法2.選擇性沉淀法3.

5、凝膠層析法4.離子交換層析法5.親合層析法蛋白質(zhì)抗原制備1．超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。1．超速離心法特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。2、選擇性沉淀法常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同）；常用33～50％

6、飽和度的硫酸胺。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。3．凝膠層析法（凝膠過濾法）原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時(shí)，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時(shí)間內(nèi)被洗脫出來；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。3．凝膠層析法（凝膠過濾法）4．離子交換層析法原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷

7、不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個(gè)部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。4．離子交換層析法5．親和層析法（親和色譜）原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過此柱時(shí)，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結(jié)合；當(dāng)改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達(dá)到純化的目的。優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。5．