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《多肽抗原的設(shè)計與抗體制備ppt課件》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、多肽抗原的設(shè)計與抗體制備多肽抗原的設(shè)計多肽的固相合成和純化多肽的交聯(lián)和免疫抗多肽抗體的檢測和功能學(xué)鑒定抗體的純化怎樣利用Internet的免費資源尋找與抗體相關(guān)的信息抗合成肽類抗體制備程序免疫原性肽的選擇肽的合成、純化與鑒定載體蛋白的選擇連接劑的選擇載體蛋白/肽連接物免疫動物McAb的制備ELISA篩選抗體血清反應(yīng)性收集陽性血清Westernblot,Immunofluorescenceassay鑒定抗體的生物學(xué)功能陽性抗體的純化抗體制備常用的免疫原1：表達純化一段或全長的重組的帶GST,Histag的融
2、合蛋白Abnovacorporation2：利用合成肽制備抗體AVIVASYSTEMSBIOLOGYLIFESPANBIOSCIENCES3：利用純化的天然蛋白免疫原性肽選擇的基本程序利用在線設(shè)計軟件或DNAStar篩選抗原性強的多肽序列盡量使用N端或C端的序列該序列經(jīng)Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptidecompanion軟件判定易于合成的14-16個氨基酸免疫原性肽選擇的注意事項避開信號肽，磷酸化，糖基化位點避開很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如
3、zincfinger，SH2domains，GTPbindingsites。有些蛋白在成熟的過程中會切割掉一小段肽段。如果選用MBS交聯(lián)方法，需要在N端或C端加上C對于有些基因來說，可能含有不止一個轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（transcriptvariants），這時就要在這些轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的共有序列中尋找抗原多肽利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫輔助設(shè)計..UniProtKB-Swiss-ProtentryP26992[CNTFR_HUMAN]Ciliaryneurotrophicfactorreceptoralpha.h
4、tm多肽的固相合成此法的基本過程是：基于Fmoc化學(xué)合成，將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子保護性氨基酸的羧基（已經(jīng)活化）作用（用NMM,HBTU作偶聯(lián)劑）形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即可以得到目標多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產(chǎn)物。合成原料Fmoc-AA(prot)-Wangresin提供肽鏈延伸反應(yīng)的固相顆粒狀介質(zhì)例如：Fmoc-His(Trt)-WangresinProt：Boc,tBu,Tr
5、t,OtBu側(cè)鏈活性位點的保護基團Fmoc:α-NH2保護基團：Boc:Trt:Fmoc-AA(Prot)-OHSolvent1:DMFSolvent2:20%pipdine/DMFSolvent3:0.4MNMM/HBTU/DMFSolvent4:50%ACN/DMFSolvent5:methylenechlorideSolvent6:94%TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O標準合成程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF10
6、0:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64Reagent(AA)100:00:00off150.4MNMM/HBTU/DMF100:40:00on16DMF100:00:30on3標準切割程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64methylenechloride100:00:
7、30on65Dry100:10:00on16TFA202:00:00on17TFA100:00:30on18methylenechloride100:00:30on39Dry100:02:00on1多肽合成的一般常識固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。為了保證合成的效率和純度，我們在設(shè)計多肽抗原時，一般設(shè)計14-16aa的多肽。減少多肽序列中多個困難性氨基酸Cys,Met,Arg,orTrp的含量。避免多肽序列中連續(xù)3到4個疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）
8、避免Asp-Pro序列避免多肽序列中最后一個氨基酸是Pro。PIWIL3SR0015FFLKHGSNFQNPPPCaspase2SR0024TDTVEHSLDNKDGPCaspase7SR0032DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都沒有多肽兩端的氨基酸對多肽溶解性的影響要遠大于其中間序列，因此要避免其兩端有連續(xù)的兩個疏水性氨基酸。Ago2SR0009IVEHMVQHFKTQIF極難溶DGCR8SR0004L
