大黃魚(yú)Rac基因cDNA全長(zhǎng)克隆及分析PPT課件

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1、大黃魚(yú)Rac基因cDNA全長(zhǎng)克隆及分析主要內(nèi)容研究背景與意義技術(shù)路線結(jié)果與分析結(jié)論致謝語(yǔ)研究背景與意義大黃魚(yú)屬于硬骨魚(yú)綱鱸形目石首魚(yú)科黃魚(yú)屬,又名黃花魚(yú)、黃瓜魚(yú)、大黃花魚(yú)，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種，也是福建省的主要養(yǎng)殖種類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、世代增加，病害問(wèn)題越來(lái)越趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了大黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，從其自身的抗病力入手，提高魚(yú)體自身的免疫力來(lái)抵抗病原微生物的侵襲是一個(gè)很好的途徑。1、Rac蛋白是小分子GTP結(jié)合蛋白R(shí)as超家族中最大的亞家族。2、Rac在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。3、近來(lái)發(fā)現(xiàn),Rac與細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)，是

2、一種免疫相關(guān)因子，本實(shí)驗(yàn)期望克隆大黃魚(yú)Rac基因序列，為以后進(jìn)一步研究與分析奠定基礎(chǔ)。技術(shù)路線拼接cDNA全長(zhǎng)分析提取肌肉組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA保守區(qū)擴(kuò)增3’RACE擴(kuò)增5’RACE擴(kuò)增分析查找序列設(shè)計(jì)引物結(jié)果及分析1、肌肉總RNA的提取結(jié)果圖11.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大黃魚(yú)肌肉總RNARNA條帶清晰，表明RNA無(wú)明顯降解，可用于逆轉(zhuǎn)錄cDNA。在200-300bp之間有一條明顯條帶而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，證明反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成功，cDNA模板可用。2、cDNA模板檢測(cè)結(jié)果圖2通過(guò)擴(kuò)增β-actin基因檢測(cè)cDNAM：DNAMarker；1：特異性擴(kuò)增；2

3、：以水做模板的陰性對(duì)照M12圖3凝膠電泳檢測(cè)保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNAMarker；1：以水作為模板的陰性對(duì)照；2：特異性擴(kuò)增可看到一條約530bp的條帶，條帶較清晰，而陰性對(duì)照無(wú)條帶。表明擴(kuò)增得到的條帶可能就是所需條帶，將瓊脂糖塊回收做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3、保守區(qū)擴(kuò)增結(jié)果M12產(chǎn)物回收產(chǎn)物與載體的連接轉(zhuǎn)化初篩重組子圖4凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物M：DNAMarker；1：以水作為模板的陰性對(duì)照；2:以PCR產(chǎn)物為模板的陽(yáng)性對(duì)照；3-6：菌落PCR4、PCR篩選克隆子結(jié)果M123456隨機(jī)挑4個(gè)克隆子均含有約530bp的目的條帶，都為陽(yáng)性克隆5、3’RACE第一輪PC

4、R結(jié)果圖6凝膠電泳檢測(cè)3ˊRACE第一輪反應(yīng)產(chǎn)物M：DNAMarker；1：第一輪反應(yīng)產(chǎn)物；第一輪擴(kuò)增得到一條較亮的1100bp左右的條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶.6、3’RACE第二輪PCR圖7凝膠電泳檢測(cè)3ˊRACE第二輪反應(yīng)產(chǎn)物M：DNAMarker；1：第二輪產(chǎn)物第二輪擴(kuò)增得到一條大小介于250-500bp之間的條帶，與目的條帶預(yù)期大小基本相符，陰性對(duì)照無(wú)條帶，表明該片段可能就是所需片段，將瓊脂糖塊回收做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。7、3’RACE克隆產(chǎn)物的鑒定結(jié)果圖8凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物M：DNAMarker；1：以水作為模板的陰性對(duì)照；2：第二輪PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照

5、；3-4：菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩個(gè)菌落均含有目的條帶8、5’RACE第一輪PCR結(jié)果圖10凝膠電泳檢測(cè)5ˊRACE第一輪反應(yīng)產(chǎn)物M：DNAMarker；1：第一輪反應(yīng)產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生100-400bp的拖帶，但還沒(méi)有明顯條帶9、5’RACE第二輪PCR結(jié)果圖11凝膠電泳檢測(cè)5ˊRACE第二輪反應(yīng)產(chǎn)物M：DNAMarker；1：以水作為模板的陰性對(duì)照；2：第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)第二輪擴(kuò)增,在300bp左右處有特異性條帶出現(xiàn)并且陰性對(duì)照無(wú)條帶產(chǎn)物回收產(chǎn)物與載體的連接轉(zhuǎn)化初篩重組子10、5’RACE克隆產(chǎn)物的鑒定圖12凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物M：DNA

6、ladder；1：以水作為模板的陰性對(duì)照；2：以第二輪PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照；3-5：菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3個(gè)菌落均含有目的條帶圖14Rac基因部分序列及由此推測(cè)的氨基酸序列圖中陰影部分是編碼區(qū)；下劃線標(biāo)注為終止密碼TAA；方框中是加尾信號(hào)AATAAA獲得的片段大小為1272bp，其中包含的編碼區(qū)579bp，編碼193個(gè)氨基酸。5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)80bp3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)613bp，具有脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)AATAA和polyA尾巴結(jié)論本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其它動(dòng)物Rac基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT－PCR和RACE方法擴(kuò)增出大黃魚(yú)Rac基因cDNA全長(zhǎng)1272bp,其中編

7、碼區(qū)（ORF）為579bp,編碼193個(gè)氨基酸。致謝語(yǔ)感謝韓芳老師在整個(gè)畢業(yè)論文設(shè)計(jì)過(guò)程中給予的悉心指導(dǎo)，感謝她對(duì)我孜孜不倦的教誨！同時(shí)感謝課題組的全體老師和同學(xué)給予的鼓勵(lì)和無(wú)私的幫助！