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《免疫標(biāo)記技術(shù)》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、免疫標(biāo)記技術(shù)主要內(nèi)容免疫熒光技術(shù)放射免疫分析法酶免疫分析法免疫印跡法用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)用熒光素、放射性核素或酶標(biāo)記的抗體或抗原是目前廣泛應(yīng)用的敏感可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測。免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescencetechnique)又稱熒光抗體技術(shù),是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。此技術(shù)是用不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記抗體(或抗原),再與組織或細(xì)胞中的相
2、應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,通過熒光反應(yīng)檢測抗原抗體的一種技術(shù)。三種方法直接染色法:將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定溫度和時間染色,洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,在熒光顯微鏡下見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接免疫熒光可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞(如T細(xì)胞和B細(xì)胞)或病原體的檢查;也可用于組織者沉著的免疫復(fù)合物檢查。優(yōu)點(diǎn)是特異性高,操作簡便,比較快速缺點(diǎn)是檢查多種抗原,需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。間接染色法:如果檢查組織或細(xì)胞上的未知抗原,可將抗
3、原直接與相應(yīng)抗體(不標(biāo)記熒光)結(jié)合,此為第一抗體,作用一定時間后,洗去未反應(yīng)的抗體,再把能與第一抗體特異結(jié)合有熒光標(biāo)記的抗抗體即免疫球蛋白抗體(第二抗體)加入,如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng),則抗體被固定,并與第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合,形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物,再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體,在熒光顯微鏡下可見熒光。間接免疫熒光間接染色法克服直接法需制備多種熒光素標(biāo)記抗體的復(fù)雜操作,用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體就能與種屬相同的所有動物的抗體結(jié)合,檢查各種未知抗原或抗體,且敏感性高。缺點(diǎn)
4、是,由于參加反應(yīng)的因素較多,受干擾的可能性也較大,判斷結(jié)果有時較難,對照較多,時間長。抗補(bǔ)體染色法:簡稱補(bǔ)體法,是間接染色法的一種改良法。利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理,用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。染色程序分為兩步:先將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加在抗原標(biāo)本上,使其發(fā)生反應(yīng),水洗,再加標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應(yīng),形成復(fù)合物,則補(bǔ)體被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體便與補(bǔ)體發(fā)生特異性反應(yīng),使之形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物,發(fā)出熒光
5、。該法優(yōu)點(diǎn)與間接法相同,且只需一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,便能檢測各種抗原-抗體系統(tǒng)。因為補(bǔ)體的作用沒有特異性,可與任何哺乳動物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。缺點(diǎn)是參與反應(yīng)的成分多,染色程序較復(fù)雜,操作較麻煩。技術(shù)特點(diǎn)免疫熒光技術(shù)將抗原和抗體的特異性與形態(tài)學(xué)檢查結(jié)合,能實現(xiàn)快速、敏感、定位。但不能觀察組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu),標(biāo)本不能永久保存,熒光有自然消退現(xiàn)象,需及時觀察及時照相;在實驗中容易有非特異性熒光干擾。放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)放射免疫分析法應(yīng)用競爭性結(jié)合原理,用放射性
6、核素標(biāo)記抗原(或抗體)與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合,通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射性活性判斷結(jié)果??蛇M(jìn)行超微量分析,敏感性高,特異性強(qiáng),準(zhǔn)確性好,可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。兩種方法液相法:將待檢標(biāo)本(含胰島素抗原)與定量放射性核素標(biāo)記的胰島素(抗原)和定量抗胰島素抗體混合,經(jīng)一定時間作用后,分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離抗原,分別測定這兩部分的放射性活性,計算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中,待檢標(biāo)本的胰島素抗原與放射性核素標(biāo)記的胰島素競爭性結(jié)合。非標(biāo)記抗原越多,標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標(biāo)記抗
7、原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量成一定函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后,即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量。固相法:將抗原或抗體吸附到固相載體表面,然后加待檢標(biāo)本,最后加標(biāo)記抗體,測定固相載體的放射性活性。放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛,可用于包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)、維生素、藥物、IgE等。但由于有放射性污染,近年有逐漸被非放射性免疫分析法取代的趨勢。酶免疫分析法(enzymeimmunoassay,EIA)酶免疫分析法是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用結(jié)
8、合,使酶作用于底物后顯色,以顏色變化來判斷試驗結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測定儀可作定量分析、敏感度可達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。這些酶具有一定的穩(wěn)定性,制成酶標(biāo)抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原,后者主要測定可溶性抗原與抗體。本法既無放射性污染又不需昂貴的測試儀器,且試劑穩(wěn)定、易保存、操作簡便、結(jié)果判斷較客觀,既可定性也可定量分析等,已廣泛用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子檢測等領(lǐng)域。酶聯(lián)免疫吸附