改良羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

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1、改良羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)詢診斷中的應(yīng)用作者:趙寧單位:貴州省疾病預(yù)防控制中心婦保所遺傳室,貴州貴陽【關(guān)鍵詞】羊水;細胞培養(yǎng);產(chǎn)前診斷;染色體;核型分析;羊水細胞直接培養(yǎng)羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備是產(chǎn)前診斷染色體病的主耍手段[l]oIII于羊水細胞培養(yǎng)一直存在技術(shù)要求高、難度人、培養(yǎng)時間長、易污染、分裂相少等問題,許多醫(yī)療單位的產(chǎn)前診斷屮仍未能開展羊水細胞檢測工作。多年來,世界各地對羊水細胞的培養(yǎng)及其在染色體制片上雖然不斷改進,但羊水細胞培養(yǎng)與染色體制片仍冇一定難度。近年來針對羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)進行了探索和改良,對孕18?24W孕婦,實施羊膜腔穿

2、刺術(shù)抽取羊水,將羊水細胞液直接作用于培養(yǎng)瓶底部進行培養(yǎng)[2]。此改良羊水細胞培養(yǎng)技術(shù),可減少細胞大量丟失,獲得冇效地細胞克隆,大大提髙培養(yǎng)成功率,現(xiàn)報告如下。1資料與方法1.1資料來源2004-2007年,100例經(jīng)產(chǎn)前篩查提示高危者和遺傳咨詢門診的有不良奸產(chǎn)史的孕婦,年齡26?40歲,孕周18?24W,在孕婦知情同意后實施羊膜腔穿刺術(shù)。1.2方法121羊水采集方法B超引導(dǎo)處位,無菌條件下,釆用7號腰穿針穿刺。最先用5ml注射器抽取2ml羊水棄去,再換10ml注射器抽収羊水共30ml,分別注入一次性無菌離心管中。1.2.2改良羊水細胞直接培

3、養(yǎng)以1000r/min離心8min棄去上清液,保留每管0.5ml羊水細胞層,以滴管打勻,分別接種于5()ml培養(yǎng)瓶底部,擰緊瓶蓋放置超凈工作臺中靜止3()min,再沿培養(yǎng)瓶邊緣緩緩加入4ml羊水培養(yǎng)液,使其覆蓋細胞懸液,并擰緊瓶蓋置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6d后,更換培養(yǎng)液并在倒置顯微鏡下觀察細胞綸長情況。鏡下可見培養(yǎng)瓶底有若T較好的梭形細胞,繼續(xù)培養(yǎng)并每天觀察。2?3d后,小堆細胞己長成人的克隆,并出現(xiàn)成對圓形透亮細胞時,即可進行細胞收獲。若貼壁細胞牛長緩慢,對棄掉培養(yǎng)瓶中的液體,加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),直到貼壁細胞生長良好為止。平

4、均在培養(yǎng)后9?lid進行細胞收獲,終止前4h加入秋水仙素25g/L1滴,最終濃度為50g/L或加入秋水仙索12.5g/L—滴,最終濃度為25g/L,處理15h,使細胞停止在分裂相中期。在倒置顯微鏡下可見許多分裂相細胞核,細胞圓而大,相互聯(lián)接。1.2.3嚴(yán)重血性羊水的處理羊水標(biāo)本中滲有少量紅細胞不需處理,如遇到嚴(yán)重血性羊水,立即在羊水中加入無菌肝素1滴或以10()0r/min,離心SminJn,吸取上清液及沉淀液表層于無菌離心管,形成0.5ml羊水細胞懸液,以備接種使用。換液時,需搖動培養(yǎng)瓶,倒出液體加入等量培養(yǎng)基。1.2.4羊水細胞收獲收獲

5、時將細胞刮沿培養(yǎng)瓶底輕輕刮下克隆細胞,利用倒直顯微鏡可觀察克隆細胞己經(jīng)漂浮起,吸入離心管。再用75%生理鹽水沖洗,使其完全脫落后,以1000r/min,離心8min,吸取上清液,留0.5ml懸液備用。1.2.5低滲在0.5ml懸液管中加入已置37°C預(yù)溫的75%KC1低滲液3ml,并用手指輕彈管錐或用滴管輕輕吸打,使其混勻,置37°C水浴箱中低滲5min后。以1000r/min,離心8min,吸取上清液,留0.5ml懸液沿管壁滴入新鮮配置的固定液(甲醇:冰酷酸3:1)4ml,用手指輕彈管錐或用滴管輕輕吸打,使細胞均勻分開,2次固定60min

6、后冰箱過夜。1.2.6顯帶常規(guī)制片,80°C烤片3h,胰酶消化,G顯帶染色。按照人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN1995)標(biāo)準(zhǔn)進行核型分析診斷。常規(guī)計數(shù)15個,分析3個分散良好的細胞核型,異常核型的要計數(shù)30個分裂相。2結(jié)果2.110()例孕婦的羊水細胞培養(yǎng),1次性羊水穿刺培養(yǎng)成功93例,2次羊水穿刺成功4例,總成功率為97%。培養(yǎng)收獲時間人多數(shù)為9?12d,最短收獲為9d,最長13d。2.2超過35歲高齡孕婦36例,占總數(shù)36%;產(chǎn)前篩查高危42例,占總數(shù)42%;有不良妊產(chǎn)史17例,占總數(shù)17%;TORCH病毒陽件.3例,山總數(shù)3%;

7、夫妻一方為平衡易位攜帯者2例,占總數(shù)2%02.3在培養(yǎng)成功的97例中,染色休止常核型93例,界常核型3例。界常檢出率3.09%,其中1例為47,XY,+21,行引產(chǎn)術(shù);1例為46,XY,-15+t(15q→15p:22p→22q),行引產(chǎn)術(shù);1例為45,X,+21/46,XYo3討論3.1改良羊水細胞培養(yǎng)影響羊水細胞培養(yǎng)成功率的因素很多[2]。鬲質(zhì)量的羊水細胞培養(yǎng)及收獲技術(shù)是進行羊水架色體分析診斷的關(guān)鍵。因此,在改良羊水細胞直接培養(yǎng)技術(shù)方面注重了孕周的選擇、種植的技術(shù)、培養(yǎng)的環(huán)境及收獲時問。(1)通過羊水采集培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)孕周

8、小于18W的羊水,其屮脫落細胞較少,貼壁的羊水細胞相對更少。而大于25W的羊水中冇形成分增多,嚴(yán)重地影響了活細胞的貼壁。因此,確定羊水最佳采集時間在孕18?24W,此時羊水細胞為

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