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《db34 t 196-1999 雜交水稻及其親本種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度的基因指紋鑒定法》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)雜交水稻及其親本種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度的基因指紋鑒定法RulesforhybridanditsparentsinricetestingMolecularidentificationofgenuinenessandpurityDB34/T196-19991范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用基因指紋鑒定種子真實性和品種純度方法中的定義、原理、儀器、試劑和溶液、程序、結(jié)果計算以及結(jié)果報告。本標(biāo)準(zhǔn)適用于雜交水稻及其親本種子真實性和品種純度的檢測。2引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版
2、時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討、使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。GB/T3543.2-1995農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T3543.5-1995農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定3定義本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。水稻基因指紋某一品種DNA結(jié)構(gòu)和組成的特征。4原理品種的不同是由于其遺傳物質(zhì)DNA組成和結(jié)構(gòu)不同而致，因此，可以利用RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）分子標(biāo)記技術(shù)，對不同雜交水稻組合及其親本進(jìn)行PCR（PolymeraseChainReaction）
3、擴(kuò)增反應(yīng)，從中篩選出能夠區(qū)別不同雜交水稻組合及其親本的多態(tài)性DNA片段。在比較分析的基礎(chǔ)上，將那些具有基因型特異性的DNA片段進(jìn)行克隆、測序，借助計算機(jī)軟件設(shè)計并合成特異性標(biāo)志引物。利用這些標(biāo)志引物，同受檢材料進(jìn)行穩(wěn)定的特異性序列擴(kuò)增，根據(jù)有無標(biāo)記帶的出現(xiàn)，從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確地鑒定雜交水稻組合及其親本的目的。5儀器a)PCR擴(kuò)增儀。b)高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為10000rpm以上。c)電泳儀，滿足穩(wěn)壓500v以上。d)紫外光透射儀。e)微量進(jìn)樣器和與之配套的吸頭，規(guī)格為20μl、100μl、1ml。f)重蒸水蒸餾器。g)冰箱
4、，低溫（-20℃以下）和普通型。h)照像機(jī)，帶紫外光濾光片。i)高壓滅菌鍋。j)量筒，規(guī)格為50ml、100ml、500ml。安徽省技術(shù)監(jiān)督局1999-12-30發(fā)布2000-01-01實施DB34/T091-1993k)薄壁PCR擴(kuò)增管，規(guī)格為0.2ml。l)Eppendorf離心管，規(guī)格為1.5ml。m)天平，感量為0.1g。6試劑和溶液6.1試劑試劑等級要求為化學(xué)純或化學(xué)純以上。a)三羥甲基氨基甲烷（Tris）b)乙二胺四乙酸鈉（EDTA）c)氯化鈉（Nacl）d)十二烷基磺酸鈉（SDS）e)異丙醇f)乙醇g)4種脫
5、氧核苷酸（dNTP）h)TaqDNA聚合酶i)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記j)特異性引物k)瓊脂糖l)溴化乙錠m)溴酚藍(lán)n)蔗糖o)乙酸p)重蒸餾水6.2溶液a)DNA提取液100mmol/LTris—HCL，20mmol/LEDTA（pH8.0），500mmol/LNacl，1.5%SDS，高壓滅菌后，在（4±2）℃的環(huán)境下保存。b)凝膠緩沖液和電泳緩沖液40mmol/LTris—HCL，1mmol/LEDTA（pH8.0），高壓滅菌后在（4±2）℃的環(huán)境下保存。c)6倍的凝膠加樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液，在
6、（4±2）℃的環(huán)境下保存。d)溴化乙錠熒光染色液稱取1.0g溴化乙錠溶于100ml水中，磁力攪拌至完全溶解，然后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，在（4±2）℃的環(huán)境下保存。e)10倍反應(yīng)緩沖液500mmol/LKCL，100mmol/LTris—HCL（pH8.0），25mmol/LMgcl2，0.1%（W/V）明膠。7程序7.1取樣DB34/T091-1993檢驗樣品的扦樣，分樣和保存，按GB/T3543.2的規(guī)定執(zhí)行。檢驗樣品的重量為500g，試驗樣品的數(shù)量為400粒，若僅作真實性鑒定則檢驗數(shù)量為50粒。7.2樣品DNA提取a)取單粒
7、受檢種子粉碎至粉末狀，裝入1.5ml的離心管中。b)加600μlDNA提取液，50℃條件下水浴1h，在此期間，振蕩2次-3次。c)在10000rpm、4℃的條件下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一只1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置片刻。d)離心10min（條件同上），棄上清液，將沉淀物用200μl的70%乙醇洗滌，再離心10min（條件同上），重復(fù)洗滌兩次。e)將沉淀物置常溫下30-60分鐘后，溶于20μl重蒸餾水中。7.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)7.3.1擴(kuò)增反應(yīng)方法用PCR特異性引物（根據(jù)鑒別的雜交水稻組合及其
8、親本的不同而選擇適宜的引物，引物選擇見（附錄A）同受檢種子的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。7.3.2擴(kuò)增反應(yīng)條件每35μl反應(yīng)體積中包括0.1mmol/L的dNTP混合物，正向和反向引物各0.2mmol/L，2μlTaqDNA聚合酶和2μl提取物（含50ng左右的水稻基因組DNA），加3.5μl10倍
