丹參酮IIA磺酸鈉穩(wěn)定性試驗(yàn)

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1、第六章丹參酮IIA磺酸鈉相關(guān)雜質(zhì)及穩(wěn)定性分析6.1丹參酮IIA磺酸鈉相關(guān)雜質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定丹參酮IIA磺酸鈉原料在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中都會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性問題，如酸性增強(qiáng)、含量降低等現(xiàn)象，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中監(jiān)控其相關(guān)物質(zhì)成為必要，提供高純度的相關(guān)物質(zhì)對(duì)照品成為很大挑戰(zhàn)。隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高，ICH要求盡可能提供單雜大于0.1%的相關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和可能的產(chǎn)生機(jī)制，構(gòu)效關(guān)系和藥理毒數(shù)據(jù)等。因此我們從丹參酮IIA磺酸鈉原料生產(chǎn)過程中的精制母液中分離純化獲得相關(guān)物質(zhì)，并和丹參酮IIA磺酸鈉原料中的相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行HPLC對(duì)照，再通過LC-

2、MS和1H-NMR分析，最終確定其結(jié)構(gòu)。BaolinWang等從丹參酮IIA磺酸鈉原料中通過色譜分離純化、LC-MSn和NMR鑒定推測(cè)出八種相關(guān)物質(zhì)；QiaogenZou等從丹參酮IIA磺酸鈉原料中通過色譜分離純化、UV、LC-MS和NMR鑒定推測(cè)出六種相關(guān)物質(zhì)。而其磺化過程中的副產(chǎn)物和雜質(zhì)成分研究還不夠完善，我們通過制備液相技術(shù)分離純化丹參酮IIA磺酸鈉精制母液中的組分，尋找確定丹參酮IIA磺酸鈉原料中的相關(guān)物質(zhì)，通過分子量和氫譜數(shù)據(jù)鑒定出三種相關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，分別確證為丹參酮IIB磺酸鈉（2）、丹參酮

3、I磺酸鈉（4)紫丹參甲素磺酸鈉（5/6），其中4已作為藥典標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)對(duì)照品（中國(guó)藥典2000年版二部附錄VB），但2和5/6尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道得到純物質(zhì)。[1,2]6.1.1儀器與原料VarianSD-1液相制備及色譜裝填系統(tǒng)，色譜柱L&L4001,1inch.×25cm，色譜柱4002,2inch,×25cm；孔徑12nm粒徑5μm色譜填料ODS-AQ100g，理論工作壓力1500psi，YMC;孔徑12nm粒徑10μm色譜填料PLRP-S150g，理論工作壓力650psi，AngilentTec

4、hnologies；Waters2695/2489高效液相色譜儀；色譜柱AngilentExtendC185μm，4.6×15cm；400M核磁共振波譜儀，NMRAvanceIII400MHz，瑞士公司；超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，ACQUITYTIMUPLC&Q-TOFMSPremier，USAWaters公司。丹參酮IIA磺酸鈉車間精制母液（自制）；純化水；甲醇，HPLC,Tedia、FisherScientific和Merk；三乙胺（TEA),HPLC,Tedia。6.1.2方法6

5、.1.2.1樣品前處理丹參酮IIA磺酸鈉車間精制母液進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)富集前先在37℃條件下減壓旋蒸結(jié)晶后濾紙過濾在經(jīng)過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜做過濾除菌處理。6.1.2.2富集和進(jìn)一步純化選用裝填PLRP-S聚合物填料的VarianL&L4002色譜柱。實(shí)驗(yàn)體系為甲醇/水，20%～80%梯度洗脫，流速為100mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm。根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)收集樣品。6.1.2.3二步純化及精制選用裝填ODS-AQ硅膠填料的VarianL&L4002色譜柱。實(shí)驗(yàn)體系為0.1%TEA-甲醇/0.1%

6、TEA-水，20%～60%梯度洗脫，流速為25mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm。根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)收集樣品。6.1.2.4HPLC檢測(cè)在富集、純化精制過程中采用HPLC方法對(duì)樣品組成及含量進(jìn)行全程監(jiān)測(cè)。HPLC監(jiān)測(cè)體系為：AgilentExtendC18，5μm，4.6*150mm,流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm。6.1.2.5凍干經(jīng)HPLC檢測(cè)純度>98%的樣品進(jìn)行凍干保存。6.1.2.6結(jié)構(gòu)鑒定將完成凍干的樣品，進(jìn)行LC-MS和1H-NMR檢測(cè)。6.1.3結(jié)果與討論6.1.3.1丹

7、參酮IIA磺酸鈉原料與精致母液的相關(guān)物質(zhì)組成圖1丹參酮IIA磺酸鈉原料HPLC檢測(cè)圖譜丹參酮IIA磺酸鈉原料HPLC檢測(cè)結(jié)果見圖1。根據(jù)圖中結(jié)果顯示，丹參酮IIA磺酸鈉原料中含有5%左右的總雜含量，主要包含了六中相關(guān)物質(zhì)（編號(hào)1,2,3,4,5,6)，其保留時(shí)間分別為13.122min，13.474min，15.576min，17.139min，19.196min及19.433min。其中，4為已確認(rèn)的丹參酮I磺酸鈉，并作為藥典標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)物質(zhì)對(duì)照品（中國(guó)藥典2000年版二部附錄VB），而其余相關(guān)物質(zhì)

8、藥典中尚未提供相對(duì)關(guān)照品。為簡(jiǎn)化相關(guān)物質(zhì)的富集工作，采取從車間精制母液中富集提取相關(guān)物質(zhì)的方法。丹參酮IIA磺酸鈉車間精制母液HPLC檢測(cè)結(jié)果見圖2。圖中結(jié)果顯示，精制母液中含有保留時(shí)間為13.495min（a）和19.122（b）的相關(guān)物質(zhì)，其含量分別為15.6%和32.6%，遠(yuǎn)高于原料中相關(guān)物質(zhì)含量。圖2丹參酮IIA磺酸鈉車間精制母液HPLC檢測(cè)圖譜6.1.3.2相關(guān)物質(zhì)的富集與一步純化根據(jù)圖3結(jié)果顯示，利用L&L4002柱進(jìn)行一次富集后，可獲得HP