北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系

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1、MembraneBiophysics尹長城北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系2.膜蛋白的拓?fù)鋵W(xué)為什么要了解膜蛋白的拓?fù)鋵W(xué)？蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能膜蛋白的功能具有跨膜方向性了解膜蛋白的功能必須了解其膜拓?fù)鋵W(xué)什么是膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)？(membraneproteintopology)1.蛋白質(zhì)序列中的跨膜片斷那些部位插膜2.蛋白質(zhì)在膜上的取向那些部分位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，那些部分位于細(xì)胞膜的外側(cè)2.1膜蛋白拓?fù)淙∠虻幕驹?.1.1疏水性原則脂雙層的碳?xì)滏渽^(qū)是高度疏水的區(qū)域蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域必定是高度疏水區(qū)域蛋白質(zhì)一般以?-螺旋形式跨膜跨膜?-螺旋的長

2、度一般為20個氨基酸以20個氨基酸為單位，計算蛋白質(zhì)序列的疏水性蛋白質(zhì)中疏水性大的序列，即為可能的跨膜區(qū)域2.1膜蛋白拓?fù)淙∠虻幕驹?.1.2正電荷氨基酸向內(nèi)原則對大量已知結(jié)構(gòu)的膜蛋白統(tǒng)計分析表明，荷正電的氨基酸傾向于位于胞質(zhì)一側(cè)線粒體、葉綠體中荷正電的氨基酸則位于基質(zhì)一側(cè)此規(guī)則只適用于長度小于60個氨基酸的片斷隨片斷長度的增加，正電荷氨基酸位于內(nèi)側(cè)的幾率降低正電荷氨基酸在質(zhì)膜內(nèi)外的分布肽段中正電荷所占比例與loop長度的關(guān)系質(zhì)膜內(nèi)質(zhì)膜外含電荷氨基酸肽段長度幾率分布2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.1蛋白質(zhì)疏水性分析1.以

3、10-20個連續(xù)的氨基酸為計算單位，計算該肽段疏水指標(biāo)之和（eg.1-10,2-11,3-12,etc.）作為該肽段的疏水指數(shù)（hydropathyindex）2.以疏水指數(shù)對氨基酸序號作圖3.具有高的疏水指數(shù)的一個?20個氨基酸的肽段即為可能的跨膜螺旋片斷疏水性的定量計算?Go越正（>0)，表示氨基酸越難從有機(jī)相轉(zhuǎn)移至水相，即越疏水?Go越負(fù)(<0)，表示氨基酸越易從有機(jī)相轉(zhuǎn)移至水相，即越親水?Go用來代表氨基酸的疏水性氨基酸的疏水性疏水性氨基酸：Phe,Met,Ile,Leu,Val親水性氨基酸：Arg,Asp,Lys,Gl

4、u,Asn,Gln,His細(xì)菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測實測2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.2酶解法蛋白質(zhì)包埋在脂雙層中可抵抗水解酶的作用利用水解法可判斷蛋白質(zhì)暴露于膜外的部分選擇水解酶的作用方式可判斷蛋白的取向外側(cè)加水解酶：蛋白向外部分發(fā)生水解內(nèi)側(cè)加水解酶：蛋白向內(nèi)部分發(fā)生水解2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.2酶解法制備蛋白取向一致的膜囊泡?加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶）?加入酶抑制劑終止反應(yīng)?SDS-PAGE?分析酶解法2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.2酶解法蛋白酶抑制劑必須有效保證有限酶解，不是完全酶解應(yīng)用多種水解酶，互

5、相印證結(jié)果陰性結(jié)果說明蛋白質(zhì)沒有膜外部分或膜外部分無水解酶切位點檢測方法：如所研究蛋白占大部分，可直接分析如所研究蛋白占少部分，須應(yīng)用抗體或其它標(biāo)記方法分析2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.3同位素標(biāo)記法制備蛋白取向一致的膜囊泡?125I標(biāo)記?SDS-PAGE?放射自顯影分析選擇標(biāo)記方式可判斷蛋白的取向外側(cè)標(biāo)記：蛋白向外部分被標(biāo)記內(nèi)側(cè)標(biāo)記：蛋白向內(nèi)部分被標(biāo)記同位素標(biāo)記法2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.3免疫學(xué)方法制備蛋白取向一致的膜囊泡?加入膠體金標(biāo)記的針對特定肽段的單克隆抗體?電子顯微鏡觀察?分析2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究

6、方法2.2.4化學(xué)標(biāo)識法極性試劑不能插膜：標(biāo)記蛋白質(zhì)膜外部分非極性試劑可以插膜：標(biāo)記蛋白質(zhì)膜內(nèi)部分將化學(xué)標(biāo)識物事先用放射性同位素標(biāo)記，反應(yīng)后用放射自顯影檢測2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.4化學(xué)標(biāo)識法制備蛋白取向一致的膜囊泡?加入同位素標(biāo)記的識別特定位點的化學(xué)標(biāo)識試劑?SDS-PAGE?放射自顯影2.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.5特殊部位定位法糖基化位點：位于細(xì)胞膜的外側(cè)磷酸化位點：位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)通過分析蛋白質(zhì)上的這些位點即可推知相應(yīng)修飾位點的拓?fù)淙∠?.2膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)的研究方法2.2.6融合蛋白法原理：特定蛋白質(zhì)在特定

7、的細(xì)胞器內(nèi)方有活性將待定蛋白基因與報告蛋白基因融合將融合基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)測定報告蛋白的定位優(yōu)點：原位細(xì)胞器定位缺點：融合蛋白可能破壞原蛋白的拓?fù)淙∠蛉诤系鞍卓赡芷茐脑鞍椎臉?gòu)象及生化活性2.3影響膜蛋白拓?fù)淙∠虻囊蛩?.信號肽蛋白質(zhì)剛合成時N端帶一條短肽-信號肽，長度為15-25氨基酸，帶正電荷信號肽的功能阻止新生肽鏈過早折疊，以利于轉(zhuǎn)運與膜上特異受體結(jié)合，實現(xiàn)選擇性跨膜轉(zhuǎn)運正電荷使得信號肽不能跨膜轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致蛋白選擇信號肽朝內(nèi)的拓?fù)淙∠颍▓D）2.3影響膜蛋白拓?fù)淙∠虻囊蛩?.跨膜電位Anderson等構(gòu)建了Lep蛋白的突

8、變體，在其N端引入不同數(shù)量的正電荷在跨膜電位存在時，蛋白質(zhì)的N端朝內(nèi)當(dāng)膜電位消失時，蛋白質(zhì)的N端朝外正電朝內(nèi)依賴于膜電位（圖）細(xì)胞的電位內(nèi)負(fù)外正，正電向內(nèi)能量上有利2.3影響膜蛋白拓?fù)淙∠虻囊蛩?.膜上負(fù)電荷磷脂的比例Kruijff等構(gòu)建了E.coli突變株，引