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1、浙江大學膠體金免疫標記培訓班資料浙江大學電子顯微鏡室浙江大學生物技術(shù)研究所膠體金免疫標記技術(shù)培訓班技術(shù)資料胡東維洪健徐穎浙江大學2001年10月20浙江大學膠體金免疫標記培訓班資料一、膠體金的制備根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生
2、的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對一致、直徑3～16nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能夠去除這些殘基。雙標記或制備5-10nm的膠體金時建議使用該方法。利用檸檬酸為還原劑，可以制備12～150nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時增加。因此做單標記時，建議使用該方法制備12-16nm直徑的膠體金。
3、除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液時一次配完，暫時不用的可以用1.5ml試管分裝為1ml保存（-20℃）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時可硅化處理（1％雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時，烘干）。配制各種試劑時均使用雙蒸水，隨后再用0.22mm微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復多次使用，不用時應(yīng)密封保存，以防污染。制備好的膠體金保存壽
4、命較長，可4℃保存6個月以上或室溫下保存1-2個月。當出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長時間后應(yīng)進行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期。1、單寧酸/檸檬酸鈉法制備3～16nm膠體金(1)取一250ml三角瓶，加入79ml雙蒸水和1ml1％氯化金，預熱至60～70℃。(2)取一50ml燒杯，加入4ml1％檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25mMK2CO3。預熱至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5ml時，對pH的影響不大，K2CO3可以省略。(3)將上
5、兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。20浙江大學膠體金免疫標記培訓班資料檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）450003420004450064120847010410162、白磷還原法制備5nm膠體金(1)取250ml三角瓶一個，加79ml雙蒸水，1ml1%氯化金，并用0.25MK2CO3將溶液調(diào)至中性（pH7.0）。(2)取0.2ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5ml試管中，再加0.8ml乙醚，混勻。取0.7ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進行中和)。(3)室溫下輕輕搖勻15min，然后
6、加熱沸騰并保持5min，自然冷卻。3、檸檬酸三鈉法制備12-30nm膠體金(Frens,1973)(1)取250ml三角瓶一個，加100ml雙蒸水及1ml1%氯化金，加熱沸騰；檸檬酸鈉(ml)膠體金(nm)5124163242.830(2)取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中?；靹?，再保持沸騰30min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。注意：20浙江大學膠體金免疫標記培訓班資料(1)由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在
7、制備完成后必須進行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。(2)膠體金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個月。但決不可保存在0℃以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。二、蛋白-金復合體的制備一般認為膠體金粒子表面為一層AuCl2，因此，粒子表面帶有負電荷，這種負電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時為中性。由于在
8、pH=pI時蛋白溶解度最
