病毒學(xué)-病毒的檢驗

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1、第四節(jié)病毒的檢驗good常用的病毒檢驗方法包括：一、病毒的分離鑒定二、病毒感染性的檢測三、病毒顆粒檢測四、病毒的血清學(xué)檢查五、病毒的分子(蛋白和核酸)檢測一、病毒的分離鑒定病毒的分離與鑒定可為病毒感染提供最為直接的病原學(xué)證據(jù)，同時可為進一步的病毒學(xué)研究提供材料。病毒的分離和鑒定（含義）：指從病人、帶毒者、外界環(huán)境中采集標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚?采用一系列物理、化學(xué)、生物學(xué)等手段,將病毒從標(biāo)本中分離出來,并通過有關(guān)特異性方法鑒定屬于何種病毒,這一方法稱為病毒的分離與鑒定。病毒的分離與鑒定包括：1、病毒材料的采集與準備→2、病毒的分離與培養(yǎng)→3、病毒的形態(tài)學(xué)觀察

2、→4、病毒的理化特性測定→5、病毒的血清學(xué)鑒定及病毒的分子生物學(xué)鑒定等基本過程。（一）標(biāo)本的采取與送檢病料采集適當(dāng)與否,直接影響病毒的檢測結(jié)果。一般可采集發(fā)病或死亡動物的組織病料、分泌物或糞便等,主要因動物及病毒的種類而異,例如檢測犬細小病毒或輪狀病毒,一般應(yīng)采腹瀉幼犬或犢牛的糞便;懷疑為口蹄疫的豬或牛,則應(yīng)采其水皰液及水皰皮送檢。應(yīng)注意下列原則：1.對本身帶有雜菌(如咽喉拭子、糞便)或易受污染的標(biāo)本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。3.血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后2～3w內(nèi)各取1份

3、血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。標(biāo)本處理：采集樣本在接種細胞、雞胚或動物之前,都需要做適當(dāng)?shù)奶幚?以保證病毒分離的成功幾率。采集的器官或組織樣本：如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結(jié)等,可取一小塊進行充分研磨,加入含青、鏈霉素的Hanks液,離心取上清液作為接種物;鼻液、膿汁、乳汁等分泌物或滲出液、糞便,應(yīng)加入高濃度的抗生素,充分混勻后,置4℃冰箱內(nèi)處理2~4h或過夜,離心后取上清做接種用;咽喉拭子在取樣后應(yīng)迅速將其浸泡入含有2%小牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反復(fù)凍融3~5次,離心后取上清液作為接種材料。（二）病毒的分

4、離與培養(yǎng)細胞培養(yǎng)、雞胚和實驗動物可用于病毒的分離與培養(yǎng),其中細胞培養(yǎng)是用于病毒分離與培養(yǎng)最常用的方法。用于病毒分離與培養(yǎng)的細胞有原代細胞、二倍體細胞株和傳代細胞系,一般說來,本動物的原代細胞最為敏感,但不如傳代細胞方便易得.例如豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細胞,但該細胞生長緩慢,通常用PD5(豬甲狀腺細胞系)取代。培養(yǎng)方法常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),有的病毒如輪狀病毒,初次分離時旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的成功率較靜置培養(yǎng)高。1、病毒的分離不同的病毒分離時采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學(xué)特性。主要有細胞培養(yǎng)法、雞胚接種法、動物接種

5、法等,而對細胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。（1）動物接種法是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。動物的接種途徑要根據(jù)病毒種類、實驗動物種類、接種材料等選擇合適的接種途徑。動物接種途徑的選擇正確與否對提高病毒分離成功率也起到重要作用。常見病毒常用實驗動物及接種途徑P37在動物實驗的期間或結(jié)束時采集動物血液檢測病毒或特異性抗體。實驗動物采血分為致死性采血和非致死性采血兩種。致死性采血是指盡量采集動物血,直至動物死亡。非

6、致死性采血是指采集一定量的動物血而不致動物死亡。對采血動物,應(yīng)在禁食24h后采血。采血應(yīng)無菌操作。不同動物采用不同的采血方法。常用的有心臟采血法、眼眶采血法、頸靜脈采血法、頸動脈采血法、耳靜脈采血法等。根據(jù)實驗動物和實驗條件靈活選用。實驗動物采血雞胚對多種病毒敏感。不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大,因此選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑是病毒分離成功的關(guān)鍵。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：尿囊腔、絨毛尿囊膜、卵黃囊和羊膜腔等。（2）雞胚培養(yǎng)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)

7、總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。（3）細胞培養(yǎng)(cellculture)法或組織培養(yǎng)法(tissueculture)一般選擇生長旺盛的敏感細胞用于病毒分離。少數(shù)病毒例外,例如犬、豬等的細小病毒,病毒的復(fù)制有賴于分裂旺盛的細胞,因此需將病毒接種與細胞培養(yǎng)同步進行。細胞培養(yǎng)技術(shù)在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒研究、疫苗研制、抗病毒藥物篩選等病毒學(xué)發(fā)展的歷程中發(fā)揮著重要作用。常見人類病毒的敏感細胞P36P36（4）分子生物學(xué)技術(shù)對體外培養(yǎng)的細胞、雞胚、動物不敏感的病毒,可采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),如基因克隆技術(shù),對病毒的全基因進行克隆,構(gòu)建表達載體,并能表達出病毒樣

8、顆粒。（三）病毒的鑒定步驟：1、初步鑒定2、接種動物的觀察3、最終鑒定1、初步鑒定(1)根據(jù)臨