銀杏莖段的組織培養(yǎng)研究

銀杏莖段的組織培養(yǎng)研究

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1、銀杏莖段的組織培養(yǎng)研究利用銀杏細胞的大圮培養(yǎng)來工業(yè)化生產(chǎn)銀杏次生物質(zhì)代謝產(chǎn)物,是一條比較可行、又節(jié)省土地、實現(xiàn)集約化經(jīng)營的一條途徑。而細胞培養(yǎng)的第一步需要穩(wěn)定的葉源,利用莖段培養(yǎng)可以為愈傷組織的建立提供源源不斷的葉片來源。建立穩(wěn)定的葉源,一方面是獲得較多的葉片數(shù)址,另一方面是獲得較大的葉而積。本'-以次得大址葉片或葉片具有較大的葉面積為目標,研究了莖段培養(yǎng)的位1IIW仃頂芽的上段、帯仃腋芽的中段、帶仃了葉的卜?段.在培養(yǎng)過程中器官發(fā)生存在較人差異),及芽分化情況。利用激素和添加稀土對葉片的誘導、葉片數(shù)目、葉而積等指標進行調(diào)

2、控。鑒于頂芽和腋芽在培養(yǎng)模式和分化條件的不同.以5個優(yōu)良銀杏品種胚培養(yǎng)的1個月齡的無菌苗各部分器官為材料,測定不同品種間幼苗各段的激素含fit分析銀杏莖段快緊中位置效皿的原因,為解決銀杏組培中的技術(shù)問題提供理論參占依肚1材料與方法1.1材料44號、45號、28號、79號、53號5個品種成熟胚培養(yǎng)出的一個月齡的無菌幼苗的莖段為外植體。無菌苗的培養(yǎng)同第三章。1-2培養(yǎng)基12.1芽誘導培養(yǎng)基選擇MS、DCR、N6、改良MS(NH4NO3減丫)4種基術(shù)培養(yǎng)基。附加NAAO」-O.5mg/L,6-BAO」~2.0!w/L,活性炭0.

3、25%,稀土0.5~30mg/L。12.2莖段腋芽的誘導在上述培養(yǎng)基生長的無菌幼苗,按部位分3種:帶仃頂芽的上段0.5cm左右?帶腋芽的中段1cm左右、帶仃子葉腋芽卜?段1cm左右,分別接種在上述不同培養(yǎng)基上。123芽伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)1個“后,在原培養(yǎng)基上繼代一次后將誘導生長I個”的芽苗繼代在伸長培養(yǎng)基上:MS.DCR、N6、改11MS不加激索的培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月。13銀杏雌、雄株莖段的離體培養(yǎng)接種時何:分別在2004年2月15日(1)、3月80(11).3月1713(111).4月8日(IV)、,月2I3(V)?材料處理:在

4、I期,芽還沒有萌動;在II期,芽剛剛開始萌動時.収銀杏成年大樹的雌、雄枝條(仍處于木質(zhì)化階段).在實驗室用門來水培養(yǎng),促其腋芽萌發(fā),待芽長出后,収具芽接種不同的培養(yǎng)基上。在111、W、V這三個階段,由于這時腋芽或頂芽己經(jīng)萌發(fā),頂芽己捕出新悄,収新梢切段做外植體。材料滅菌處理:収回枝條用肥皂粉洗干凈,再在流水中沖洗4~5小時,先用70%乙醇滅菌30S,再在4%的NnClO浸泡■分8min>14min>20min3個消希時間段。腋芽誘導培養(yǎng)基:⑴改ft.MS+0.25%AC:(2)WPM+0.25%AC(活性炭):(3)WPM

5、+NAA0.3mg/L+BA3.0me/L增殖培養(yǎng)基:(1)WPM+O.25%AC:(2)改良MS+0.25%AC1.4培養(yǎng)基的滅菌上述培養(yǎng)基中各附加3%的蘆糖,0.65%的瓊脂,調(diào)pH值至5.88,分裝。最后在三洋牌全門動高壓滅菌鍋中火菌30mim13培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25±2*C?光強為1000-20001X的日光燈照明,14h光照,10h黑暗。在培養(yǎng)同時.觀察齊種培養(yǎng)呈上外悄休的牛.長狀況,測雖芽苗髙度.対數(shù)擁用spss11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。“莖段高度和葉而積的測定到一定培養(yǎng)時間后.每個品種均勻取出6棵?雖取

6、其高度?葉面積。葉面積測足用方格紙法。1.7石蠟切片制作同第四章。1$激素含址的測定5個品種培養(yǎng)成熟胚為外植體接種在DCR培養(yǎng)基上,生長一個月后,収高度一致、生長狀況一致的銀杏無菌幼苗.剪成上段0.5cm,中段1.0cm,F段1.0cm三部分,連同葉片、根段、子葉共6部分0.5g,做激素測定。內(nèi)源激素含雖采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELSA)測定。即稱取樣品0.5g,用80%冷甲醉研惦提取后于4*Cs5000g條件卜離心lOmin,液經(jīng)C18柱純化后,用N?氣吹L:測ABA、IAA時?要將樣品甲酯化.即將2氣吹干后的樣品,以甲

7、醇溶解,在冰浴條件下與過圮的重氮甲烷反應至黃色,lOmin后加半Sf0.2mol/L乙酸屮醉破壞過量的車組屮烷(黃色消失),用N2氣吹干,再以pH7.4的磷酸韁沖液溶解后進行含量測定。(南京農(nóng)業(yè)大學爾聯(lián)免疫測定室測定)。2結(jié)果與分析2.1頂芽的培養(yǎng)2.1.1不同品種頂芽培養(yǎng)奇度的比較將5個品種的無菌苗的頂芽培養(yǎng)在不加激索的MS培養(yǎng)基上,1個月后?頂芽高度出現(xiàn)差異。從表5?1中可以看出.不同品種頂芽高度以45號最高.53號最低.但方差分析表明?品種之何無顯著性差異(F0.01=4.43>F=1.267).表5?1不同品種頂芽

8、培養(yǎng)高度的比較Tabic5-1Comparisionofhighofterminalbudsinfivedifferentofspecies品種號NO.ofspecies培養(yǎng)基Medium接種數(shù)cxpalntsamontIS芽高度(cm)highofterminalbuds44MS+NAA0.O4-6-

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