蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌檢疫鑒定方法

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1、ICS65.020.01B16中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準S/TXXXXXXXXX蘋果殼色單隔鞄潰瘍病菌檢疫鑒定方法InspectionandIdentificationofBotryosphaeriastevensiiShoemaker（送審稿）（本稿完成日期:2011-11-28）XXXX-XX-XX實施XXXX-XX-XX發(fā)布中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總發(fā)布本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T23635-2009的的規(guī)則起草。本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標起草單位：中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局，

2、中國檢驗檢疫科學研究院本標準主要起草人：王衛(wèi)芳，張秋娥，黃英，嚴進。蘋果殼色單隔砲潰瘍病菌檢疫鑒定方法1范圍本標準規(guī)定了植物檢疫中蘋果殼色單隔他潰瘍病菌的檢疫鑒定方法。木標準適用于蘋果殼色單隔抱潰瘍病菌所有寄主植物的原木、木制品（含木質包裝）、枝條、茁木和果實的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注FI期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括所冇的修改單）適用于木文件。SN/T2122進出境植物及植物產品檢疫抽樣3原理依據(jù)蘋果殼色單隔抱潰瘍病菌的為害癥狀、菌落特征、病菌的無性

3、型和冇性型形態(tài)進行該病菌的檢疫鑒定。4試劑及主要儀器設備4.1培養(yǎng)基及試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA：每1（）0（）mLPDA由200g去皮馬鈴薯，2（）g葡萄糖，18g瓊脂配制而成，121°C高壓滅菌20min）＞燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA：1OOOmLOA由30g燕麥片，20g瓊脂配制而成，121°C高壓滅菌20min）,100%乳酸、1%的次氯酸鈉（NaOCl）、70%酒精、無菌水。4.2儀器與設備立體顯微鏡、生物顯微鏡（具汕鏡和測微尺）、普通天平（感量（）.1g）、超凈工作臺、生物培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、載玻片、蓋玻片、打孔器（總徑4mm）o5檢疫

4、與鑒定5.1癥狀檢查檢查抽取的原木、木制品、枝條和苗木樹皮的表面是否冇潰瘍，枝條是否冇枯死癥狀，檢查果實是否有腐爛癥狀（癥狀描述和圖片參見附錄A.3、B.l）o將冇可疑癥狀的樣品帶回實驗室作進一步檢驗。5.2室內檢驗5.2.1樣品中的病菌形態(tài)學觀察從樹皮上采集子實體，橫切片后，將切片組織轉移到滴有無菌水的載玻片上，在常溫下晾干后加一滴100%乳酸并蓋上蓋玻片，制成非永久性玻片。觀察了實體(尤其是了座)的形態(tài)特征，記錄分生砲子、產砲細胞或者子囊、子囊砲子的形態(tài)。分別測最50個子囊砲了、子囊、分生砲子和產砲細胞、10個無性型子座和10個有性型子座的大小，

5、拍攝并保存數(shù)碼照片，同時將子實體轉入培養(yǎng)基中純化保存。5.2.2分離培養(yǎng)在樣品小如果沒有發(fā)現(xiàn)病原菌的子實體，則采用組織分離培養(yǎng)法，分離病部的病原菌。取發(fā)病部位的病健交界組織，切成4mmX4mm的小塊，用1%的NaOCl表面消毒10min,無菌水沖洗3遍，置于直徑9cm的PDA平板上，每皿放4?6塊，于25°C條件下12h黑暗/光照培養(yǎng)，將長出的菌落邊緣的菌絲轉至新的PDA平板上純化。5.2.3分離物培養(yǎng)性狀和形態(tài)學觀察將純化后的菌株在PDA平板上培養(yǎng)6d,釆用火焰消毒的打孔器從菌落上打取直徑4nun的菌絲體塊，轉移到新的PDA平板上，在全黑暗條件下，

6、分別于20°C、25°C進行培養(yǎng)，每處理垂復3次，觀察菌落形態(tài)、計算菌落的牛長速度、分牛抱子器形成的速度。待分牛抱子器形成后，觀察分牛地子器及分生孑包子的形態(tài)，測量其大小，拍攝并保存數(shù)碼照片。6鑒定標準6.1菌落特征在PDA平板上，菌落関形，初期白色，培養(yǎng)5?6d后呈深橄欖色，月?冇大量的氣生菌絲生成，在20°C、25°C黑暗條件下菌落生長速率分別為6mm/d、11mm/d。培養(yǎng)至6d菌落中央即現(xiàn)糾結成粒狀的人量黑褐色分化抱子器。培養(yǎng)至9d少量的分牛:孑包子器頂部即現(xiàn)口色粘稠狀分牛了包子

7、才

8、,培養(yǎng)至15d整個培養(yǎng)皿布滿黑褐色分生抱子器，并且噴出大量

9、口色抱子團(菌落特征圖參見附錄B.2)。6.2無性繁殖器官的形態(tài)分生抱子器，單?；蚓叟?，埋主于黑色的子朋上，成熟時部分開裂，深褐色至黑色，近球形，直徑可達600pm,壁由三層組成，外層黑褐色，山厚壁細胞組成，中間層山深褐色的薄壁細胞組成，內層由透明的薄壁細胞組成?？卓谇?，圓形，具乳突。分生抱子梗圓柱形，透明，無隔膜，極少數(shù)分支具隔膜。產孑包細胞(11?)12?15pmx4~5pm,夕卜生芽殖型產葩，離散,圓柱形,透明，光滑,無限生長。分牛砲子器成熟后噴射出白色分牛砲子團。分生砲子透明，光滑，厚壁，長橢圓形至卵形，大小(23.5x)25.1?25.7

10、(?27.4)pmx(12.4?)13.2?13.5(?14.3)pm,平均大小為25.4±1.0pmxl3