γ—氨基丁酸在小兒難治性癲癇患者腦組織中表達(dá)和臨床意義

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1、V—氨基丁酸在小兒難治性癲癇患者腦組織中表達(dá)和臨床意義【摘要】目的：觀察Y-氨基丁酸（Y-aniinobutyricacid,GABA）在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)，探索其在難治性癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：15例患兒均來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)外科癲癇研究治療中心，經(jīng)PET/CT.MRI和VEEG及臨床癥候?qū)W評(píng)估等綜合定位方法，確定致癇灶并行功能神經(jīng)外科學(xué)手術(shù)治療（實(shí)驗(yàn)組）和3例無(wú)癲癇病史的手術(shù)患兒（腦腫瘤2例,腦血腫1例）（對(duì)照組）腦組織。采用免疫組化的方法（pv-9000）標(biāo)記兩組標(biāo)本中丫-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元,

2、于光鏡（X200）下計(jì)數(shù)，對(duì)兩組GABA能神經(jīng)元個(gè)數(shù)進(jìn)行比較,同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)組穎葉皮層光鏡（X100,X200）下其他病理組織學(xué)改變。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1.2研究方法實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)中收集病灶腦組織標(biāo)本，標(biāo)本收集后置于10%多聚甲醛溶液中固定24?48h,隨后常規(guī)石蠟包埋，切片，常溫保存?zhèn)溆谩?biāo)本用病理科專用的石蠟切片機(jī)行冠狀面連續(xù)切片，切片厚度為3um,每個(gè)標(biāo)本分別切取10張切片，然后，將全部切片排序，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取2張切片，分別行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色方法采用pv-9000法（二

3、步法免疫組化檢測(cè)試劑），切片用二甲苯脫蠟水化，然后用乙醇去除二甲苯，放入0.3%過(guò)氧化氫溶液中室溫條件下孵育20min,用以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，提高抗原的活性。高溫高壓抗原熱修復(fù)后，0.01mol/LPBS溶液（pH值7.2?7.4）反復(fù)沖洗，然后加入10%正常山羊血清置37°C恒溫水浴箱封閉抗原2h,甩去多余液體，不沖洗，滴加I抗小鼠抗人GAD67單克隆抗體1：500,購(gòu)于北京博奧森公司，置于37°C室溫下孵育1h；PBS清洗3次，每次3min。后續(xù)操作步驟嚴(yán)格按PV-9000采用免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書要求（購(gòu)買于北京中杉金橋生物公司）

4、，滴加試劑IPolymerHelper（即用型），置于37°C室溫下孵育20min,PBS清洗3次，每次3min，滴加試劑2（polyperoxidase-anti-mouse/rabbitlgG（即用型），置于37°C室溫下孵育30min,PBS清洗3次，每次3min,暗室中DAB顯色（用濃縮型DAB試劑盒）3?5min,神經(jīng)元染成棕褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞，蒸徭水沖洗終止反應(yīng)，酒精脫水，二甲苯去除酒精，中性樹脂封片。染成棕褐色的神經(jīng)元為丫-氨基丁酸能神經(jīng)元（又稱陽(yáng)性細(xì)胞）。顱內(nèi)腫瘤切除術(shù)及顱內(nèi)血腫清除術(shù)的患兒腦組織切片為對(duì)照組，分別滴加I抗、II抗進(jìn)行

5、染色，方法同實(shí)驗(yàn)組。釆用彩色病理圖像分析軟件（MoticImagesAdvanced3.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在顯微鏡放大200倍的視野下，定位為腦組織皮質(zhì)，然后在皮層的不同視野下分別選取3個(gè)不重疊視野，計(jì)算出每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，最后求取平均數(shù)，為該標(biāo)本每視野陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)組HE染色觀察光鏡下皮層神經(jīng)元形態(tài)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P隨著對(duì)抗癲癇藥物的臨床應(yīng)用，對(duì)GABA的儲(chǔ)存、釋放、降解有重要作用的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體(Y-aminobutyricacidtransporter

6、,GAT)引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。GAT表達(dá)異?；蚬δ苁軗p是癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元高興奮性的原因之一。一般認(rèn)為，人類穎葉癲癇患者腦組織的海馬區(qū)GABA能中間神經(jīng)元在顯微鏡下的病理變化為神經(jīng)元出現(xiàn)破壞性病變，神經(jīng)元出現(xiàn)缺失或減少，退變等形態(tài)結(jié)構(gòu)的紊亂。這種神經(jīng)元的破壞和減少可能是由于海馬區(qū)GAT表達(dá)下降，對(duì)突觸間隙GABA的攝取減少，從某種程度上講是癲癇放電后引起的一種應(yīng)激反應(yīng)，但這是一種保護(hù)性反應(yīng)。GAT表達(dá)下降可以起到一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，使得增加GABA能神經(jīng)元抑制作用［6］。進(jìn)一步的研究已經(jīng)證實(shí)，癲癇的發(fā)生不僅是由于興奮性神經(jīng)元作用的增強(qiáng)，而且也在于

7、抑制性神經(jīng)元作用的減弱。其中抑制性神經(jīng)元的減少在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用。在目前的返回抑制學(xué)說(shuō)研究中存在這樣的兩種理論，一種是谷氨酸能神經(jīng)元，代表了興奮性神經(jīng)元，其存在于腦組織的海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞，更能引起興奮性作用增強(qiáng)的是存在于齒狀回顆粒細(xì)胞中的苔狀細(xì)胞；另一種是GABA能神經(jīng)元，代表了抑制性神經(jīng)元，其存在于腦組織的海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞，但引起抑制性作用的是齒狀回顆粒細(xì)胞中的籃狀細(xì)胞；這兩種細(xì)胞均起源于齒狀回顆粒細(xì)胞。本研究的目的就是在于觀察癲癇患者腦組織中GABA能神經(jīng)元的表達(dá)如何，從而探討其在癲癇發(fā)病中的影響作用。返回抑制學(xué)說(shuō)認(rèn)為

8、不論是感染還是外傷等，只要存在一定的刺激，并且這種刺激達(dá)到一定的刺激強(qiáng)度，作用于齒狀回顆粒細(xì)胞，齒狀回顆粒細(xì)胞受到刺激并且