微衛(wèi)星技術(shù)（SSR）及其對(duì)海洋生物的遺傳研究進(jìn)展【文獻(xiàn)綜述】

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1、畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述生物工程微衛(wèi)星技術(shù)（SSR）及其對(duì)海洋生物的遺傳研究進(jìn)展摘要：DNA簡(jiǎn)單重復(fù)序列從1974年在海洋生物中被發(fā)現(xiàn),到1989年“微衛(wèi)星”術(shù)語開始使用這段時(shí)間是這種新型分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展階段。伴隨著PCR技術(shù)的發(fā)明、成熟與拓展,微衛(wèi)星DNA以其多態(tài)性高、隨機(jī)分布、共顯性遺傳、重復(fù)性好等特點(diǎn)在生物學(xué)的個(gè)體及系統(tǒng)發(fā)育方面得到很廣泛的應(yīng)用。本文詳細(xì)地介紹了如何運(yùn)用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的基本原理及方法,對(duì)不同殼色花紋文蛤進(jìn)行遺傳分析，然后概括了在海洋動(dòng)、植物的遺傳學(xué)中,微衛(wèi)星DNA在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因鑒定和標(biāo)記以及系譜認(rèn)證等

2、領(lǐng)域的研究,展望了其在海洋生物分子育種、基因克隆、生物保護(hù)等方面的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記；微衛(wèi)星DNA；PCR技術(shù)；遺傳多樣性；遺傳圖譜。近年來,微衛(wèi)星作為一種分子標(biāo)記,已成為種群研究和進(jìn)化生物學(xué)最常用的分子標(biāo)記之一,廣泛地應(yīng)用于生物雜交育種、遺傳連鎖圖譜、種群遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生等研究領(lǐng)域。[1]1微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的基本原理微衛(wèi)星是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(多數(shù)為2～6個(gè))為單位的多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,如(CA/GT)n、(AG/TC)n等(n為核心基本序列重復(fù)次數(shù))，亦稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR

3、)、短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeats,STR)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP)等。在基因組中，微衛(wèi)星座位一般是由核心序列和兩側(cè)序列組成的。其中,微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA長(zhǎng)度的變化，是產(chǎn)生其多態(tài)性的根源，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星核心序列突變率相對(duì)較高(10-5～10-3)，而每個(gè)微衛(wèi)星座位的兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的篩選，關(guān)鍵是要了解微衛(wèi)星座位兩側(cè)的核苷酸序列,尋找其中的特異保守區(qū)以設(shè)計(jì)引物。具體操作過程包括DNA文庫的

4、構(gòu)建，含微衛(wèi)星DNA克隆的篩選、鑒定和測(cè)序，也可以通過GenBank、EMBL和DDBJ等DNA序列數(shù)據(jù)搜索微衛(wèi)星序列，再根據(jù)微衛(wèi)星兩側(cè)序列在同一物種內(nèi)高度保守的特性，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增微衛(wèi)星序列，后經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過譜帶相對(duì)遷移距離的比較，便可知某個(gè)微衛(wèi)星座位上的多態(tài)性。[2]2微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的主要步驟微衛(wèi)星標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)便易行,主要包括微衛(wèi)星的獲得、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)。[12]2.1微衛(wèi)星位點(diǎn)的獲得主要有兩種方法:包括經(jīng)典的分子克隆法和現(xiàn)代的磁珠富集法。這兩種方法都是首先構(gòu)建小片斷基因組

5、文庫(一般為150～500bp),經(jīng)典的方法是利用同位素標(biāo)記,磁珠富集法用生物素標(biāo)記的重復(fù)寡核苷酸作為探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選,一般說來,應(yīng)該根據(jù)不同的物種設(shè)計(jì)不同的重復(fù)寡核苷酸來篩選陽性克隆。根據(jù)得到的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,就可以得到微衛(wèi)星序列,進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及研究分析。也可以通過構(gòu)建cDNA文庫,克隆后對(duì)克隆載體直接進(jìn)行測(cè)序分析,由于無效等位基因的存在,使得一些獲得的微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離孟德爾遺傳,因此,在使用微衛(wèi)星標(biāo)記之前,應(yīng)先檢測(cè)其孟德爾遺傳形式,去除無效等位基因。2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增[7]微衛(wèi)星的引物長(zhǎng)度一般為18～24bp,退火溫度為50～58

6、℃,遵循引物設(shè)計(jì)原則,G+C含量應(yīng)在45%以上。設(shè)計(jì)引物可以應(yīng)用Primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì),也可以直接利用已發(fā)表的相關(guān)引物。由于不同的引物需要不同的反應(yīng)條件,因此,應(yīng)首先摸索最佳的反應(yīng)條件(如模板濃度、退火溫度和酶的用量等),再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及分析微衛(wèi)星的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過幾種方法進(jìn)行檢測(cè)：一是用約3%的瓊脂糖或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,EB染色；二是用5%～7%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,進(jìn)行銀染,凝膠成像儀進(jìn)行照相分析；三是通過自動(dòng)化DNA分析儀進(jìn)行檢測(cè)。通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。2微衛(wèi)星標(biāo)記的特點(diǎn)[12]3.1共顯性遺

7、傳特性與其它遺傳標(biāo)記(如RFLP、RAPD等)不同,微衛(wèi)星標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性遺傳特性,即對(duì)來自親本雙方的等位基因型可以同時(shí)表現(xiàn)出來,因而可以用于雜交子代的鑒別等。3.2　數(shù)量多、分布廣泛而均勻Hamada等指出,在人類基因組中,平均每10～50kb片段有一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。微衛(wèi)星廣泛分布在基因組中,除染色體的著絲粒及端粒區(qū)域外,染色體的其它區(qū)域廣泛分布微衛(wèi)星。[3]道指出,有大量的微衛(wèi)星位于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄區(qū),包括蛋白編碼區(qū)和表達(dá)序列標(biāo)簽區(qū)。但這些區(qū)域的微衛(wèi)星數(shù)量是有限的,一般<20%。3.3　多態(tài)性豐富、雜合度高、通用性好微衛(wèi)星分子標(biāo)記的一個(gè)顯著特點(diǎn)是

8、高度的多態(tài)性,經(jīng)常是一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有多個(gè)等位基因。形成高多態(tài)性的機(jī)理目前比較公認(rèn)的理論是“滑動(dòng)錯(cuò)配"和姐妹染色體的不等交換。一般說來,一個(gè)微衛(wèi)星DN