定量聚合酶鏈反應(yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用

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1、定量聚合酶鏈反應(yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用屮華I矢學(xué)檢驗(yàn)朵志2000年第2期第23卷綜述作者：張華許叔祥單位：張華(200020上海市南洋醫(yī)學(xué)放射免疫檢測(cè)中心)；許叔祥(200020上海市南洋醫(yī)學(xué)放射免疫檢測(cè)中心)隨著熱穩(wěn)定DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)發(fā)生了革命性的飛躍，使得其應(yīng)用于臨床成為可能，為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及其研究提供了新的手段。已用于臨床的PCR方法至今人都為定性分析，既無(wú)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，也無(wú)質(zhì)控，其最終產(chǎn)物用電泳法鑒定容易產(chǎn)生非特異性條帶，結(jié)果重復(fù)性差，對(duì)靠性低，因而給臨床診斷帶來(lái)混亂。市于定性沒(méi)有量化指標(biāo)，所以無(wú)法

2、用于疾病隨訪和療效觀察。如何提高靈敏度和穩(wěn)定性，并能對(duì)樣品中的DNA和RNA進(jìn)行定量分析是迫切需要解決的課題。一、目前臨床采用的幾種PCR定量測(cè)定方法1?固體捕獲技術(shù)的運(yùn)用。(l)PCR-酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法：Marrin等［1］川固相捕獲技術(shù)和酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行PCR定量。所有的反應(yīng)均在微孔板上進(jìn)行。由于引物上標(biāo)有生物素，因而PCR產(chǎn)物上也標(biāo)有相對(duì)量的生物素，它能定量地被鏈霉親和素包被的微孔板捕獲，然后用一熒光索標(biāo)記的寡核井酸探針雜交，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗熒光素抗體，再加入化學(xué)發(fā)光底物，用發(fā)光儀檢測(cè)其光信號(hào)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照定量

3、DNA或RNA。(2)熒光標(biāo)記引物法：Londgraf等［2］將一對(duì)引物分別標(biāo)記生物索和熒光索，擴(kuò)增灰得到5’端分別標(biāo)有生物素和熒光索的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，其中標(biāo)有生物素的一端被包被有鏈霧親和索的微孔板吸附，另一端的熒光素被激發(fā)后發(fā)光，根據(jù)熒光強(qiáng)度定量DNAo(3)PCR-tW-聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：地高辛或牛物素或熒光素標(biāo)記引物，擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物即標(biāo)有地高辛或牛物素或熒光素。該產(chǎn)物被固相板上特異的探針(用生物索鏈密親和素交聯(lián)在板上)所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素或熒光素酶標(biāo)抗體■辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色［3］

4、。以上3種方法均是對(duì)固相免疫定量分析技術(shù)的靈活運(yùn)用，尤其第3種方法只需熱循壞儀和酶標(biāo)儀，因而應(yīng)川最廣，如何將這一過(guò)程自動(dòng)化是一個(gè)發(fā)展方向。2.熒光雙標(biāo)記探針?lè)ǎ浩湓硎抢肨aq酶的5’端外切酶活性。擴(kuò)增時(shí)在加入特異引物的同時(shí)加入一熒光探針，該探針為一寡核甘酸，標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)熄滅基團(tuán)，擴(kuò)增時(shí)，每形成一條DNA鏈即有一雙標(biāo)記探針被偶聯(lián)，Teq酶切去其熒光基團(tuán)，其與熄滅棊團(tuán)分離。即每擴(kuò)增一條DNA鏈，溶液屮就增加一個(gè)熒光分子，即時(shí)或擴(kuò)增后監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度,即時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比定量(Q)PCR［4］?，F(xiàn)己有將此方法研究成的專利產(chǎn)

5、殆，并發(fā)展了專用儀器ABI-7700儀器。3.內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已知量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成，上游引物用5’?熒光標(biāo)記，下游引物未標(biāo)記，在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)同時(shí)被擴(kuò)增,在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物很容易用電泳或高效液相(HPLC)分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量mRNA［5］。4.競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)牛的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源性競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一試管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物(其中一-個(gè)引物為熒光標(biāo)記)同時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR

6、產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物將在內(nèi)切位點(diǎn)處裂解為兩個(gè)片斷，而待測(cè)樣木的產(chǎn)物不變，從而被區(qū)分(電泳，HPLC等)，通過(guò)熒光強(qiáng)度測(cè)定可與競(jìng)爭(zhēng)物比較。兩模板長(zhǎng)度類(lèi)似，擴(kuò)增效率相近，由于競(jìng)爭(zhēng)模板為已知量，可推測(cè)待測(cè)RNA含量［6］。二、定量PCR的臨床應(yīng)用1.在傳染性疾病方而的應(yīng)用。(1)人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)：Atkins等［7］用QRT-PCR研究HIV感染者對(duì)疊氮胸昔(ZDV)的抗性是由于其反轉(zhuǎn)錄酶的41、67、70、215處發(fā)生了點(diǎn)突變，有助于解釋對(duì)ADT的耐藥性，可川于HIV治療方案的設(shè)計(jì)；Tetali等［8］通過(guò)測(cè)定HIV-

7、RNA的濃度，發(fā)現(xiàn)血漿中病毒量與疾病進(jìn)展和存活率的關(guān)系，并可早期檢出無(wú)癥狀攜帶者。⑵丙型肝炎病毒(HCV)：Ro山等［9］川定暈?zāi)孓D(zhuǎn)錄(QRT)-PCR檢測(cè)血清屮HCV-RNA含量和HCV基因分型，認(rèn)為是預(yù)測(cè)和監(jiān)視a■干擾素治療的重要指標(biāo)。Casanovas等［10］用QRT-PCR檢測(cè)出血淸中HCV-RNA含量高的母親傳染危險(xiǎn)率大于平均垂ft感染率(12%)。⑶乙型肝炎病毒(HBV)在乙肝的治療過(guò)程中，慢性肝炎治療終點(diǎn)的血清學(xué)標(biāo)志叩為HBV-DNA的消失。研究發(fā)現(xiàn)，可以HBV-DNAjflL清濃度的變化來(lái)評(píng)價(jià)藥物療效與病毒載

8、量的關(guān)系［11］。一般定性PCRC不能滿足臨床的需要，必須進(jìn)行定量PCR測(cè)定。1.定量mRNA。傳統(tǒng)方法的靈敏度均達(dá)不到檢測(cè)低表達(dá)mRNA的要求，因一些編碼受體和內(nèi)部信息分子的mRNA,巾于其拷貝數(shù)極低只能用QRT-PCR方法，通過(guò)在不同反應(yīng)管中加入內(nèi)標(biāo),控制RT-PCR的擴(kuò)