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1、奶制品中維生素A和維生素E的測定食品安全檢驗手冊50頁1.原理樣品中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生素A和維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用外標法定量測定。最小檢出量分別為：VA:0.8ng;α-E:91.8ng;δ-E:20.6ng。2.試劑實驗用水為蒸餾水。試劑不加說明為分析純。(1)無水乙醚：不含有過氧化物。(1)過氧化物檢查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈
2、黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍色。該乙醚需處理后使用。(2)去除過氧化物的方法：重蒸乙醚時，瓶中放入純鐵絲或鐵末少許。棄去10%初餾液和10%殘餾液。(2)無水乙醇：不得含有醛類物質(zhì)。(1)檢查方法：取2mL銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應則表示乙醇中有醛。(2)脫醛方法：取2g硝酸銀溶于少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入1L乙醇中，振搖后，放置暗處兩天（不時搖動，促進反應），經(jīng)過濾，置蒸餾瓶中蒸餾，棄去初蒸出的50
3、mL。當乙醇中含醛較多時，硝酸銀用量適當增加。(3)無水硫酸鈉。(4)甲醇：重蒸后使用。(5)重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。(6)10%抗壞血酸溶液（m/V）：臨用前蒸餾。(7)1：1氫氧化鉀溶液。(8)10%氫氧化鈉溶液（m/V）。(9)5%硝酸銀溶液（m/V）。(10)銀氨溶液：加氨水至5%硝酸銀溶液中，直至生成的沉淀重新溶解為止。再加10%氫氧化鈉溶液數(shù)滴，如發(fā)生沉淀，再加氨水溶解。(11)維生素A標準液：視黃醇（純度85%）或視黃醇乙酸酯（純度90%）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇
4、溶解維生素A標準品，使其濃度大約為1mL相當于1mg視黃醇。使用前用紫外分光光度計法標定其準確濃度。(12)維生素E標準液：α-生育酚（純度95%），δ-生育酚（純度95%）。用脫醛乙醇分別溶解以上兩種維生素E標準品，使其濃度大約為1mL相當于10mg。臨用前用紫外分光光度計法標定此兩種維生素E的準確濃度。3.儀器和設備(1)實驗室常用設備。(2)高壓液相色譜儀帶紫外分光檢測器。(3)旋轉蒸發(fā)器。(4)高速離心機。(5)小離心管：具塑料蓋1.5~3.0mL塑料離心管（與高速離心機配套）。(6)高純
5、氮氣。(7)恒溫水浴鍋。(8)紫外分光光度計。4.操作步驟(1)樣品處理①皂化稱取5g奶粉或50g牛奶（含維生素A約3μg，維生素E各異構體約為40μg）于皂化瓶中，加30mL無水乙醇，進行攪拌，直至顆粒物分散均勻為止。加5mL10%抗壞血酸，混勻。加10mL1：1氫氧化鉀，混勻。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。②提取將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有殘
6、渣，可將此液通過有少許脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。③洗滌用約50mL水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗直至水層不顯堿性（最初水洗輕搖，逐次振搖強度可增加）。④濃縮將乙醚提取液經(jīng)過無水硫酸鈉（約5g）濾入與旋轉蒸發(fā)器配套的250~300mL球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約10mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中剩下約2mL乙醚時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，
7、充分混合，溶解提取物。⑤將乙醇液移入一小塑料離心管中，離心5min（5000rpm）。上清液供色譜分析。如果樣品中維生素含量過少，可用氮氣將乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并記下體積比。(2)標準曲線的制備①維生素A和維生素E標準濃度的標定方法取維生素A和各維生素E標準液若干微升，分別稀釋至3.00mL乙醇中，并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計算出該維生素的濃度。測定條件如下表所示。1%標準加入標準的量S,μL比吸光系數(shù)Ecm波長λ,nm視黃醇10.001835325δ-生育酚1
8、00.092.8298α-生育酚100.071298濃度計算：A1.300X=××1?3E100S×10X--某維生素濃度，g/mL；1A--維生素的平均紫外吸光值；S--加入標準的量，μL；E--某種維生素1%比吸光系數(shù)；.300--標準液稀釋倍數(shù)。?3S×10①標準曲線的制備視黃醇標準溶液精確稱取視黃醇標準品5.0mg，用無醛乙醇稀釋并定容至100mL，搖勻，即可。依法吸取此液300μL，加無醛乙醇稀釋至3.0mL，并于λ=325nm處測得吸光度為0.904。按上頁公式計算：按
