細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方案-(5579)

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1、---SiO2-SS-HA/DOX、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案1.準(zhǔn)備材料：DMEM(高糖)胰酶雙抗(青霉素/鏈霉素）DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培養(yǎng)板96孔培養(yǎng)板超薄載玻片培養(yǎng)瓶(25mL)一包0.45μm濾膜滅菌：50mL，10mL，5mL離心管兩種槍頭2.實(shí)驗(yàn)方案本實(shí)驗(yàn)所用的材料為載藥的通過二硫鍵橋連透明質(zhì)酸的夾心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽條件下，二硫鍵斷裂，透明質(zhì)酸脫離，同時(shí)夾心二氧化硅中藥物得以釋放。本實(shí)驗(yàn)的目的為測定透明質(zhì)酸修飾的夾心二氧化硅（SiO2-

2、SS-HA/DOX）的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)組為SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白對照組為純細(xì)胞,分別采用HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型和L929成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞模型。采用HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)組為SiO2-SS-HA、DOX，空白對照組為純細(xì)胞。培養(yǎng)基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)雙抗(青霉素/鏈霉素)。配制不同濃度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX藥物載體培養(yǎng)基溶液。(1).以HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型:培養(yǎng)基的配置：雙抗1%血清1

3、2%DMEM87%具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：①將凍存于液氮中的細(xì)胞取出，迅速放入37℃溫水中，使細(xì)胞快速溶解。②將懸浮的細(xì)胞移至離心管中，加5mL無血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min離心去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。（每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將之前的離心管洗滌，并用移液槍來回吸，使液體混合均勻。）③將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代：將0.25%的胰酶分裝至小離心管中，每個(gè)管中2mL，凍存于-20℃，每次使用一管，避免反復(fù)凍融。①將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，蓋子旋緊，噴75%的酒精放入超凈臺。②將培養(yǎng)液倒入廢液缸，殘留

4、培養(yǎng)基用吸管吸干凈，操作完成后，培養(yǎng)瓶口------用火燒。③加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈圓形，即消化完畢，加入2mL12%DMEM終止消化，用槍吹打，使細(xì)胞懸浮。④將細(xì)胞懸浮液移入10mL離心管中，1000rmp,5min,離心。⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培養(yǎng)基，分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。⑥下一次傳代步驟同①-⑤。細(xì)胞存活率測定方法（布板，加樣）：①同傳代步驟①-④。②給每個(gè)離心管中加入定量的培養(yǎng)基，并用

5、移液槍來回吸，使液體混合均勻，將所有含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL離心管中，最終使液體體積為30mL。③96孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔，每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物，一組空白對照組，只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物。除過空白調(diào)零孔，每孔加入100μL含細(xì)胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37℃，培養(yǎng)22小時(shí)。④將0.03g谷胱甘肽加入到10mL培養(yǎng)基，充分溶解，濃度為0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培養(yǎng)基中，將

6、這兩個(gè)濃度含谷胱甘肽的培養(yǎng)基替換部分原來的培養(yǎng)基，作為對照，不需要加谷胱甘肽的孔換上新鮮培養(yǎng)基，將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37℃，培養(yǎng)2小時(shí)，具體的加樣孔見圖一。⑤將1.2mg的SiO2-SS-HA/DOX樣品溶到3mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中一份里加入1.5mL的培養(yǎng)基，再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份，其中一份加入1.5mL新鮮培養(yǎng)基，依此類推，便得到一個(gè)濃度梯度的SiO2-SS-HA/DOX樣品。SiO2-SS-HA樣品的濃度配制方法同上。⑥將0.918mg的SiO2

7、-SS-HA/DOX樣品溶到3mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同⑤。⑦將配制好的載體溶液替換原來96孔板中的培養(yǎng)基，如圖1所示。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37℃，培養(yǎng)24小時(shí)。⑧配制5mg/mL的MTT溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成MTT溶液，將孔板放------入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37℃。培養(yǎng)4小時(shí)后，將孔板中的培養(yǎng)基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100μL的DMSO，溶解孔中的甲瓚，采用酶標(biāo)儀測定，波長設(shè)定為490nm圖1藥物

8、載體布板示意圖------⑵.以L929成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞模型:------實(shí)驗(yàn)組為SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白對照組為純細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇y定藥物載體溶液對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)基的配置：雙抗1%血清12%DMEM87%具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：①將