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《超分辨率熒光顯微技術(shù)地原理和進(jìn)展》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和進(jìn)展姓名:曹寧學(xué)號(hào):104753141002專業(yè):藥理學(xué)2015年2月文案大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和進(jìn)展摘要:在生命科學(xué)領(lǐng)域,人們常常需要在細(xì)胞內(nèi)精確定位特定的蛋白質(zhì)以研究其位置與功能的關(guān)系。多年來,寬場(chǎng)/共聚焦熒光顯微鏡的分辨率受限于光的阿貝/瑞利極限,不能分辨出200nm以下的結(jié)構(gòu)。近年來,隨著新的熒光探針和成像理論的出現(xiàn),研究者開發(fā)了多種實(shí)現(xiàn)超出普通共聚焦顯微鏡分辨率的三維超分辨率成像方法.主要介紹這些方法的原理、近期進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)。史蒂芬·赫爾(Stefanw.Hell)、
2、埃里克·本茨格(EricBetzig)和威廉·默爾納(WilliamE.Moerner)因在超分辨率熒光顯微技術(shù)方面的貢獻(xiàn)共享了2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他們使用熒光分子和特殊的光物理原理,巧妙地突破了普通光學(xué)顯微鏡無(wú)法突破的“阿貝極限”,其開創(chuàng)性的成就使光學(xué)顯微技術(shù)發(fā)展為“顯納”技術(shù),能夠窺探納米世界。關(guān)鍵詞:超分辨率熒光顯微技術(shù),光激活定位顯微技術(shù),隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù),點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中為了更好地理解人體生命的作用過程和疾病的產(chǎn)生機(jī)理,需要觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、病毒、寄生蟲等在三維細(xì)胞空間的精確定位和分布.另一方面,后
3、基因組時(shí)代蛋白質(zhì)科學(xué)的研究也要求闡明:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用的時(shí)空順序;生物大分子,主要是結(jié)構(gòu)蛋白與RNA及其復(fù)合物,如何組成細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)體系;重要的活性因子如何調(diào)節(jié)細(xì)胞的主要生命活動(dòng),如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞信號(hào)傳遞等.反映這些體系性質(zhì)的特征尺度都在納米量級(jí),遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了常規(guī)的光學(xué)顯微鏡(激光掃描共聚焦顯微鏡等)的分辨極限(xy向分辨率:200nm,z向分辨率:500nm)[1].應(yīng)用傳統(tǒng)的電子顯微鏡(EM)可以達(dá)到納米量級(jí)的分辨率,能夠觀察到細(xì)胞內(nèi)部囊泡、線粒體等細(xì)胞器的定位
4、,但是由于缺乏特異性的探針標(biāo)記,不適合定位單個(gè)蛋白質(zhì)分子,也不適合觀察活細(xì)胞和細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化過程.因此,生物學(xué)家迫切希望有一種實(shí)驗(yàn)顯微方法,它既具有亞微米甚至納米尺度的光學(xué)分辨本領(lǐng),又可以連續(xù)監(jiān)測(cè)生物大分子和細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)的演化,而并不影響生物體系的生物活性.文案大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)近年來,隨著新型熒光分子探針的出現(xiàn)和成像方法的改進(jìn),光學(xué)成像的分辨率得到極大的改進(jìn),達(dá)到可以與電子顯微鏡相媲美的精度,并可以在活細(xì)胞上看到納米尺度的蛋白質(zhì)[2~5].這些技術(shù)上的進(jìn)步勢(shì)必極大地推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展,為了增強(qiáng)生物學(xué)家對(duì)于超分辨率熒光顯微成像(su
5、per-resolutionfluorescentmicroscopy)機(jī)理的理解,以下我們將介紹傳統(tǒng)的熒光顯微成像的極限,突破此極限超分辨率成像的原理以及目前國(guó)際上的最新進(jìn)展.1.光學(xué)顯微鏡與阿貝極限最簡(jiǎn)單的光學(xué)顯微鏡由2個(gè)凸透鏡組成,它利用的就是凸透鏡能將物體的像放大的原理。在此之后,荷蘭微生物學(xué)家安東尼·范·列文虎克(AntonievanLeeuwennhoek)和英國(guó)物理學(xué)家羅伯特·虎克(Roberthooke)對(duì)物體的成像原理進(jìn)行了深入研究,并改進(jìn)了顯微鏡的結(jié)構(gòu),發(fā)明了調(diào)焦系統(tǒng)、照明裝置和載物臺(tái),制造出了具有現(xiàn)代雛形的光
6、學(xué)顯微鏡[32]。他們利用改進(jìn)后的光學(xué)顯微鏡做了一系列生物學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)。1873年德國(guó)顯微技術(shù)專家恩斯特·阿貝(ErostAbbe)揭示了光學(xué)顯微鏡由于光的衍射效應(yīng)和有限孔徑分辨率存在極限的原理[33]。根據(jù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)簡(jiǎn)稱PSF,是一個(gè)無(wú)限小物點(diǎn)通過光學(xué)系統(tǒng)在像平面處的光強(qiáng)分布函數(shù)[3],也可以理解為艾里斑的光強(qiáng)分布函數(shù)),艾里斑的大小可以用其半高寬/半寬度(fullwidthathalfmaximum,簡(jiǎn)稱FWHM)來表示。在垂直于光傳播方向的平面上(x,y平面),其半高寬大約為(Δx,Δy)=λ/2nsina=λ/2NA,在光傳
7、播的方向上(z軸),其半高寬大約為Δz=2λ/2nsin2n[9]。其中λ是入射光的波長(zhǎng),n是介質(zhì)的折射率,a是物鏡的半孔徑角度,NA是物鏡的數(shù)值孔徑。分辨率不僅與光斑的半高寬相關(guān),還與成像的對(duì)比度有關(guān).以xy平面為例,對(duì)比度的概念是:在兩個(gè)同樣亮度的點(diǎn)光源光斑中間存在亮度的最小值,而點(diǎn)光源光斑的中心為亮度的最大值,此兩值之間的差與亮度最大值的比值即為對(duì)比度.當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)光源光斑距離靠近時(shí),對(duì)比度下降,而距離分開時(shí),對(duì)比度上升,其分布范圍在0~1之間.瑞利分辨率(r)的概念是:在理想的光學(xué)成像環(huán)境下,當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)光源光斑的對(duì)比度為26.4
8、%時(shí),兩個(gè)光斑中心點(diǎn)之間的距離即為瑞利分辨率.將顯微鏡的光斑在xy平面上的分布用二維的貝塞爾函數(shù)或是高斯函數(shù)來擬合(點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)pointspreadfunction,PSF)[34],計(jì)算對(duì)比度為26.4%時(shí)光斑的距離,就可以得到瑞利分辨率.寬場(chǎng)熒