高性能淀粉酶菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化進展文獻綜述

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1、文獻綜述高性能淀粉酶菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化進展1前言淀粉酶(amylase，EC3.2.1.1)以淀粉或糖原為底物,是能夠催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一群酶的總稱。它能從分子內(nèi)部水解α-1,4-糖苷鍵,廣泛存在于動物、植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市場銷售中占據(jù)了約25％的比例，應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織、石油開采等行業(yè)。由于該酶是一種有內(nèi)切活性的淀粉酶,可在中性pH條件下將淀粉水解為糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖等,從而使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化,碘的呈色反應(yīng)很快消失,故又稱為淀粉液化酶[1，2]。此外它也可作為

2、促消化劑運用于食品[3]、醫(yī)藥工業(yè)．淀粉酶的巨大潛力使其在當今社會中需求量日益提高．因此，如何獲得高產(chǎn)量、高活性的淀粉酶顯得至關(guān)重要。2淀粉酶生產(chǎn)菌株的篩選2.1初篩將在土壤中收集得到的菌株劃線接種在淀粉培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)2～4d，采用革蘭氏碘液染色，在菌落周圍有透明圈產(chǎn)生證明為產(chǎn)淀粉酶。用游標卡尺分別測量透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)兩者比值大小初步確定酶活性的高低。[4]但應(yīng)保存所有產(chǎn)淀粉酶的菌株以用來復(fù)篩，因為同一菌株在不同的培養(yǎng)基以及不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶的情況可能不同。在平皿上生長和在發(fā)酵液中培養(yǎng)也可能會有很大的差別。2.1復(fù)篩在淀粉酶生產(chǎn)菌株篩選

3、的過程中，最關(guān)鍵的是其產(chǎn)物，也就是淀粉酶的酶活的檢測。由于測定原理和底物性質(zhì)的不同，淀粉酶的測定方法已經(jīng)超過200種以上。[5]這些方法可以歸納為兩類：天然淀粉底物方法和（分子組成）確定的底物方法。以天然淀粉底物為底物的測定方法，如淀粉分解法、糖化法和色素淀粉法等。由于天然淀粉分子結(jié)構(gòu)的不確定，故不同植物來源的淀粉和不同批號的淀粉，其分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)不盡相同，因此難以達到方法學(xué)標準化，測定誤差較大。[6]目前除碘·5淀粉法和DNS外，這類方法已被淘汰。使用（分子組成）確定的淀粉酶底物和輔助酶與指示酶組成的淀粉酶測定系統(tǒng)，可以改進酶反應(yīng)的化學(xué)計量關(guān)系

4、，能更好地控制和保持酶水解條件的一致性。這些底物有小分子寡聚糖（含3-7個葡萄糖單位）和對·硝基苯酚·糖苷等。其中，麥芽戊糖和麥芽四糖是極好的淀粉酶底物，試劑穩(wěn)定，水解產(chǎn)物確定，化學(xué)計量關(guān)系明確。目前市售試劑盒就有好幾種。但是就價錢來講，較為昂貴。2.2.1DNS法測定酶活[7]利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定還原糖含量來反映淀粉酶活力是目前較常采用的方法。一般的實驗過程是：在1%淀粉溶液中加入一定量的酶液，37℃水浴5min，加DNS沸浴5min，在470nm比色，用麥芽糖同步作標準曲線，用單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化麥芽糖的量表示酶活性：麥芽糖mg

5、·5min-1·g-1。該方法測試所用試劑易得，溶液有效期長，同一批次測試精確度高。但相關(guān)文獻在工作波長、培養(yǎng)pH值、培養(yǎng)時間和顯色時間等測試條件上差異較大[8-10]，這些差異會直接影響同種測試方法所得酶活力之間的可比性。而且在滅活劑的選擇上，一般的有機滅活劑或者酸堿都會相應(yīng)的影響到DNS的顯色反應(yīng)。不同批次的DNS也會造成測得的酶活的變化，實驗可重復(fù)性差。2.2.2碘·淀粉法測定酶活[11]碘·淀粉法又稱碘量法，該種方法的基本原理是淀粉與碘反應(yīng)，生成了一種包合物(碘分子被包在了淀粉分子的螺旋結(jié)構(gòu)中了），這種新的物質(zhì)改變了吸收光的性能而變了色。而在

6、淀粉酶存在的情況下，淀粉被分解，就可以根據(jù)吸光度變化測定出淀粉的水解情況，進而推算出酶活。[12]一般的實驗過程是：在在1%淀粉溶液中加入一定量的酶液，37℃水浴15min，加碘應(yīng)用液，在660nm比色，用淀粉標準液同步做標準曲線。碘·淀粉法的酶活表示為：在37℃,15min水解淀粉5mg為1個單位。但淀粉遇碘酒究竟顯什么顏色，取決于該淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例，不同批次的淀粉可能比例不同，故該方法重復(fù)性不好，而且酶反應(yīng)線性差，測定范圍窄，高單位時往往誤差較大。盡管碘量法因底物難以標準化，反應(yīng)不成零級反應(yīng)等缺點而被認為不是理想方法，但因其簡單、快

7、速、靈敏和價廉而在國內(nèi)應(yīng)用較廣。2.2.3試劑盒檢測法[13]因為試劑盒檢測法相比于前面兩種方法較為昂貴，在生物實驗室或者大規(guī)模檢測時，一般很少使用試劑盒檢測法。試劑盒檢測一般用于臨床檢測血液或者尿液中淀粉酶的含量。該方法基本原理是利用α5-淀粉酶水解2-氯-4-硝基苯酚麥芽三糖（CNPG3）生成2-氯-對硝基苯酚，在405nm處吸光度的增加速率與樣品中的α-淀粉酶的活力成正比。3培養(yǎng)基優(yōu)化3.1常用的培養(yǎng)基優(yōu)化設(shè)計方法通常優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法是單次單因子法和正交試驗設(shè)計法。采用單次單因子法時，只是討論一種因素的影響，由于考察因素間經(jīng)常存在交互作用，

8、使得該方法并非總能獲得最佳的優(yōu)化條件。[14]正交試驗設(shè)計則注重如何科學(xué)合理地安排試驗，可同時考慮幾種因素，