ct-2△△t算法推導(dǎo).pdf

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1、△△Ct法的推導(dǎo)過程PCR指數(shù)擴增公式是：Xn=X0*(1+Ex)n[1]式中，Xn是第n個循環(huán)后目標(biāo)分子數(shù)，Xo是初始目標(biāo)分子數(shù)，Ex是目標(biāo)分子擴增效率，n是循環(huán)數(shù)。用Ct代表目標(biāo)擴增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，因此：Xt=X0*(1+Ex)Ctx[2]式中，Xt是目標(biāo)分子X達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)，是一個常數(shù)。雖然每臺機子設(shè)定閾值的熒光信號是一樣的，但是由于每份子不同雙鏈DNA能結(jié)合的SYBR的量是不同的，所以不同目的基因的Xt是不同的，但是對某個特定的基因Xt是特定的的常數(shù)。Ctx是目標(biāo)分子X擴增達(dá)到閾值時（即達(dá)到規(guī)定的拷貝數(shù)時）的循環(huán)數(shù)。對于看家基因的PCR反應(yīng)，也有同

2、樣的公式：Rt=R0*(1+ER)CtR[3]式中，ER是看家基因R擴增效率。Rt是看家基因R達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)假設(shè)目標(biāo)序列與看家基因擴增效率相同，EX=ER=E，用目標(biāo)分子數(shù)（常數(shù)）除以看家基因分子數(shù)（常數(shù)），即目標(biāo)分子與看家基因的表達(dá)量比值K，K是一個常數(shù)。K=Xt/Rt=[X0*(1+E)Ctx]/[R0*(1+E)CtR]=（X0/R0）*(1+E)Ctx-CtR[4]將Ctx-CtR稱為△Ct，（X0/R0）稱為XN（初始目標(biāo)序列與看家基因的分子數(shù)比值，其意義是經(jīng)過通過內(nèi)參校正之后的初始目標(biāo)分子數(shù)），整理上式得：XN=K*(1+E)-△Ct[5]最后用任一樣本q的X

3、N除以參照因子（calibrator，cb）（參照因子可以是正常對照也可以是相對對照）的XN得到：XN,q/XN,cb=[K*(1+E)-△Ctq]/[K*(1+E)-△Ct,cb]=(1+E)–(△Ctq-△Ct,cb)[6]于是將△Ctq-△Ct,cb稱為△△Ct，這種數(shù)據(jù)分析方法稱為△△Ct法。對于一個少于150bp的擴增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴增效率E接近于1。因此目標(biāo)序列的數(shù)目通過內(nèi)參校正之后相對于參照因子而言就是初始目標(biāo)基因數(shù)/初始參比因子數(shù)XN,q/XN,cb=2-△△Ct整理式[5]得，XN/K=2-△Ct常數(shù)K=Xt/Rt，在K≠1時

4、，即達(dá)到閾值時，目標(biāo)基因數(shù)≠看家基因數(shù)，其意義是消除實驗處理造成的目標(biāo)基因數(shù)≠看家基因數(shù)的因素后，初始目標(biāo)基因數(shù)/初始看家基因數(shù)；當(dāng)K=1時，XN=2-△Ct。我之前一直認(rèn)為算到△Ct就夠了，因為知道目的基因相對內(nèi)參表達(dá)的量XN，但是不要忘了我們還不知道K值.舉個例子：假設(shè)擴增效率E=1，對照組內(nèi)參基因（理論下每個細(xì)胞表達(dá)是一樣的）CT值20，目的基因CT值18；實驗組內(nèi)參基因CT值20，目的基因CT值17，那么X對照組=K*(1+1)-△Ct=4K;X實驗組=K*(1+E)-△Ct=8K，因為我們無法計算K值，所以不管是對照組還是實驗組目的基因與內(nèi)參基因的比值都無法得知，但是我們

5、可以計算說實驗組目的基因表達(dá)是對照組的8K/4K=2倍，得出處理過的實驗組目的基因比沒有處理過的對照組目的基因表達(dá)增加了1倍，其實我們也只是要這個目的。但是到底是要除以對照組還是隨便哪一組的，之前群里一直有人討論，但是根據(jù)我們推算，除以任何組都可以，（8K/XK）/（4K/XK）=2，但是如果是除以對照組的話，那么對照組就會變成1，實驗組直接是1的倍數(shù)，這樣作圖就更方便，所以很多人會除以對照組。這就是為什么要算△△Ct。