吖啶橙熒光染色法.doc

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1、吖啶橙熒光染色法【實驗原理】吖啶橙（acridineorange，AO）是最經(jīng)典的極靈敏的熒光染料，它可對細(xì)胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光。其激發(fā)峰為492nm，熒光發(fā)射峰為530nm（DNA）、640（RNA），它與雙鏈DNA的結(jié)合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍(lán)光（502nm）激發(fā)下，細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光（約530nm），核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)橘紅色熒光（>580nm）。吖啶橙的陽離子也可以結(jié)合在蛋白質(zhì)、多糖和膜上而發(fā)熒光，但細(xì)胞固定阻抑了這種結(jié)合，從而

2、主要顯示DNA、RNA兩種核酸。【實驗用品】1、器材熒光顯微鏡、牙簽、載玻片、蓋玻片、滴管、吸水紙。2、試劑（1）0.1mol/lpH7.0PBS液A液：NaH2PO4·H2O2.76g，加蒸餾水至100ml；B液：Na2HPO4·7H2O5.36g，加蒸餾水至100ml；取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl8.5g，用蒸餾水稀釋至100ml。（2）1%吖啶橙原液取0.1g吖啶橙加蒸餾水稀釋至100ml（臨用時配制0.01%吖啶橙染液：將1%吖啶橙原液用pH7.0PBS溶液稀釋10倍）。3、材料口腔黏膜

3、上皮細(xì)胞臨時制片或人肝癌BEL-7402細(xì)胞爬片。（1）取口腔上皮細(xì)胞涂在干凈載玻片上。（2）95%乙醇溶液固定5min。（3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。（4）蓋上蓋玻片，吸水紙吸去蓋玻片周圍多余液體，鏡下觀察?！窘Y(jié)果與觀察】熒光顯微鏡下（選用藍(lán)色激發(fā)濾片），可見含DNA的細(xì)胞核顯示黃綠色熒光，含RNA的細(xì)胞質(zhì)及核仁顯示橘紅色熒光體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞吖啶橙熒光染色【注意事項】（1）制片后一定要晾干玻片，在進(jìn)行后續(xù)步驟，否則會導(dǎo)致細(xì)胞脫落。（2）每種熒光染料，均有自己的最適pH，此時熒光最強。當(dāng)pH改變時，不

4、僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的pH緩沖液中進(jìn)行。