體內(nèi)小鼠實驗方案.doc

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1、實驗報告抗腫瘤藥物體內(nèi)活性研究一、實驗原理聚合物膠束的粒徑約為0-200nm，可以利用腫瘤組織的增強滲透保留效應(yīng)(EPR)，選擇性地透過腫瘤血管并積累在腫瘤組織，實現(xiàn)被動靶向；被特定官能團修飾的聚合物膠束則能響應(yīng)部位的物理化學變化，實現(xiàn)靶向部位的載體聚集和藥物定點釋放?？鼓[瘤藥物的反復(fù)使用容易導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)，腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性后，對結(jié)構(gòu)與作用機制不同的其它抗腫瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象極大的限制了化療藥物的療效。納米藥物傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)體、膠束、納米粒等作為MDR逆轉(zhuǎn)策略越來越引起關(guān)注。膠束能通過EPR效應(yīng)使藥物選擇性地在腫瘤部位累積和釋放，增加細胞內(nèi)藥物濃度，

2、緩控釋藥物，并通過靶向細胞上特異受體對應(yīng)的配體修飾，達到主動靶向，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥。鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，屬于蒽環(huán)類抗生素，能夠抑制癌細胞遺傳物質(zhì)核酸的合成，具有廣譜的惡性腫瘤的治療效果，廣泛用于宮頸癌細胞、卵巢癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、肺癌、肝癌等的治療。然而，阿霉素的急性和慢性毒副作用限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，急性毒副作用包括惡心、嘔吐、骨髓抑制和心率失常;慢性毒性表現(xiàn)為肝臟、大腦和腎臟的損傷，對心臟具有不可逆的劑量依賴性的損傷。用聚合物構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)，提高對疏水性藥物的包載能力和藥物穩(wěn)定性;通過小分子修飾實現(xiàn)被動和主動靶向。此外,通過相關(guān)實驗考察作為藥物載體的聚合物

3、膠束的耐藥能力，以此來證明聚合物膠束的生物安全性好、穩(wěn)定性高、載藥量高、響應(yīng)性強、靶向性準、緩控釋性能好。二、實驗?zāi)康?.運用抗腫瘤藥物在小鼠體內(nèi)評價方法，篩選出具有高表達、特異性、高親和力的主動/被動靶向、無細胞毒性、抗腫瘤效果好的聚合物膠束。2.動物體內(nèi)抑瘤實驗基于活體成像技術(shù)，建立藥物抗腫瘤效果活體動物影響研究方法。三、實驗內(nèi)容1.動物模型將狀態(tài)良好的細胞消化，用培養(yǎng)液稀釋至1×106cells/mL細胞密度，吹勻后于每只小鼠加入細胞懸液100μL，培養(yǎng)。受試溶液每孔加入100μL，每個濃度3-5個平行孔，每組10-15只裸鼠；對照組，即不加待測藥液，單一補加100μL生理鹽水，培養(yǎng)。2

4、.體內(nèi)抑瘤實驗給藥后觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤體積變化情況。3.近紅外成像的研究裸鼠在給藥2和12天后處死，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腫瘤組織，置于近紅外成像系統(tǒng)觀察。四、實驗方案1.動物模型的建立通過MTT實驗選取生物活性好、穩(wěn)定性高、載藥量高的聚合物納米顆粒（NPs），為了考察不同給藥劑量的DOX-NPs(阿霉素負載聚合物納米顆粒)和DOX·HCl溶液的抗腫瘤效果，選取HeLa細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞擴增至一定數(shù)量，且生長狀態(tài)良好，取對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化2min，l000rpm離心5min，棄去上清液，用新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，配制成1×106個細胞/m

5、L的細胞懸液。然后用注射器吸取細胞懸液，排空氣泡，注射于體重在20-22g左右的BALB/C雌性裸鼠左腋皮下組織中，每只接種100μL，約含1×105個細胞，大約共接種120只。觀察裸鼠腫瘤生長情況，并定期稱裸鼠體重，測量腫瘤大小。（實驗期間動物正常飲食喝水。）2.給藥及抑制腫瘤效果評價當腫瘤體積長到100~150mm3時，將裸鼠隨機分成4組，每組10只裸鼠(n=4)，分別為陰性對照組（生理鹽水組），DOX·HCl，NPs和DOX-NPs。陰性對照組通過尾靜脈注射100μL對照生理鹽水。DOX·HCl，NPs和DOX-NPs組分別通過小鼠尾靜脈注射100μL的用無菌生理鹽水配制的DOX·HCl

6、。并記為第一天。（給藥劑量分別為：5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg）。隔天給藥一次，給藥后小鼠正常飼養(yǎng)，每天觀察小鼠的生存狀況，每兩天記錄一次小鼠體重，并用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，根據(jù)公式計算腫瘤體積（V）和相對腫瘤體積（Relativetumorvolume，RTV），繪制時間-小鼠相對體重和時間-小鼠相對腫瘤體積變化曲線。給藥后第12天處死小鼠，摘取皮下腫瘤并稱重。腫瘤體積：V=a×b2/2（a為腫瘤的最長徑，b為腫瘤的最短徑）公式1相對腫瘤體積：RTV=Va/V0（Va為每日腫瘤體積，V0為起始腫瘤體積公式2按照以下公式：計算各給藥組的抑瘤率:Tumorinhibito

7、nratio%=(1─Vtest/Vcontrol)′100%公式3其中，Vtest為第12天時給藥組的相對腫瘤體積，Vcontrol為第12天時生理鹽水組的相對腫瘤體積。3.藥物體內(nèi)臟器分布實驗由于DOX·HCl自身具有紅色熒光，故可通過近紅外成像儀觀察藥物在裸鼠體內(nèi)各臟器的分布情況。在尾靜脈注射5mg/kg生理鹽水、游離DOX·HCl、NPs和DOX-NPs組生理鹽水溶液后,于第2、12天處死