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1、第四章植物基因工程1植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術、植物遺傳轉化技術及植物組織培養(yǎng)技術而發(fā)展起來的現代生物技術。通過植物基因工程獲得轉基因植物，在農業(yè)生產發(fā)展及植物分子生物學研究中有十分重要的意義。目前，已獲得很多有重大經濟價值的轉基因植物。2基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構建目的基因與載體的拼接重組子導入受體分子外源基因的表達和產物的分離重組子的檢測34本節(jié)主要內容根癌農桿菌介導法基因槍介導法其它轉化方法第一節(jié)植物遺傳轉化方法5常用的植物轉基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉基因方法。根據其轉化原理，可分為三大類，
2、即利用載體的轉化系統(tǒng)，不用任何載體，采用物理、化學方法直接將外源基因導入受體細胞的直接轉化系統(tǒng)以及利用植物生殖細胞等種質媒介的種質轉化系統(tǒng)?，F將這三大類系統(tǒng)的載體、轉化原理、轉化方法和受體細胞等歸納如圖4-1。67一、根癌農桿菌介導法根癌農桿菌介導法的分子機制農桿菌介導法需要具備的條件農桿菌介導法的基本流程81、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（1）冠癭瘤的起因：由根癌農桿菌對植物的侵染而引起。（2）冠癭瘤的侵染過程：細菌通過傷口進入植物，在基因水平上轉化植物。細菌DNA中的編碼基因在植物細胞中表達，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌農桿菌介導
3、法的分子機制92、Ti質粒根瘤農桿菌染色體外的遺傳物質，為共價閉合環(huán)狀的DNA分子。10為農桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；參與寄主細胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。（1）Ti質粒的功能11（2）Ti質粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)200kb12①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。13Vir區(qū)是一段長度為3
4、5KB操縱子；包含六個基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質粒DNA的三分之一。②Vir區(qū)操縱子基因的結構與功能LBRBT-DNAVir14③Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。④Ori區(qū)（originofrepli
5、cation）該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。15定向轉移到寄主植物細胞內T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產生酚類物質，誘導Vir基因的表達編碼核酸內切酶依次在RB、LB序列中產生缺口單鏈T-DNA被釋放3、T-DNA轉移的機制植物細胞酶體系合成雙鏈T-DNA鏈分子VirE2蛋白的核定位作用164、植物遺傳轉化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢載體）雙元載體（反式載體）17①Ti質粒分子量過大，一般在160～240kb；②分布各種限制酶的多個切點；③T-DNA區(qū)內含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內源激素的平衡，轉化細胞長成腫瘤，阻礙細胞的
6、分化和植株的再生；④Ti質粒不能在大腸桿菌中復制,即使得到重組質粒，也只能在農桿菌中進行擴增；⑤Ti質粒上還存在一些對于T-DNA轉移不起任何作用的基因。野生型Ti質粒不能直接作為植物基因工程載體：185、農桿菌介導的轉化質粒的構建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報告基因，選擇標記基因目的基因報告基因，選擇標記基因LBRB19啟動子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35SpromoterCaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues
7、.20（二）農桿菌介導法需要具備的條件高效的植物基因轉化受體系統(tǒng)受體植物細胞對農桿菌要有很高的親和力。具有有效的選擇系統(tǒng)。穩(wěn)定的轉化技術和基因表達。211、高效的植物基因轉化的受體系統(tǒng)成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。受體系統(tǒng)：用于轉化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。22A.植物基因轉化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來源（4）對選擇性抗生素敏感（5）對農桿菌侵染有敏
8、感性（6）具有經濟價值或理論研究意義。23B.植物基因轉化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)外
