有效磷的測(cè)定方法.doc

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1、有效磷的測(cè)定方法方法1、鉬銻抗比色法解磷菌發(fā)酵菌液（用什么培養(yǎng)基？？）經(jīng)離心處理后，取上清液，用2，4．二硝基酚作為指示劑加入1．2滴，上清液中可溶性磷酸鹽可與鉬銻抗顯色劑反應(yīng)，生成磷鉬藍(lán)，于適宜波長處進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出有效磷的含量，通過有效磷的濃度大小表示微生物溶磷能力的高低。1、實(shí)驗(yàn)所用溶液(1)鉬銻抗貯存液的制備首先量取硫酸153ml(p=約1.84g/ml)緩緩地傾入約400ml蒸餾水中，攪拌、冷卻。然后稱取lO.0g鉬酸銨溶于約60℃的300m1水中，冷卻。然后將上述硫酸溶液緩緩加入

2、此鉬酸銨溶液中，再加入5g/L酒石酸銻鉀溶液100ml，最后用水稀釋至lL，盛于棕色瓶中，放于陰暗處保存。(2)鉬銻抗顯色劑準(zhǔn)確稱量抗壞血酸1.5g，溶于lOOml鉬銻抗貯存液中。此溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，有效期為1d.(3)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(5mg/L)準(zhǔn)備稱取0.439g磷酸二氫鉀在105℃烘箱中烘干2h后冷卻，溶于200ml水中，加人5m1硫酸(p約1．84g/ml)，轉(zhuǎn)入lL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，即為磷標(biāo)準(zhǔn)液100mg/L。取此溶液準(zhǔn)確稀釋20倍即為5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液不宜久放。2、工作曲線的

3、繪制分別吸取5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12ml于50m1容量瓶中，加水稀釋大約至20m1，加入5ml鉬銻抗顯色劑，搖勻后定容，即得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在室溫20℃-25℃下放置4h后，以0mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照溶液，其余磷標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)液同時(shí)比色，并記錄在該峰值下的吸光度。以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度(mgL)為橫坐標(biāo)，繪制成工作曲線。3、菌液的制備在300ml三角瓶中分別加入50m1培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。無菌操作，每瓶接

4、入已經(jīng)活化的待測(cè)菌種，不接種菌種的作為空白對(duì)照，置于30℃搖床上，160r／min振蕩培養(yǎng)5d~7d后，取出測(cè)定有效磷含量。4、樣品的測(cè)試發(fā)酵液在4000r／min的條件下離心30min，吸取上清液，用蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，量取若干毫升加入50ml容量瓶中，滴加2．3滴2，4-二硝基酚指示劑溶液，用1mol/L氫氧化鈉溶液或硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至溶液剛呈現(xiàn)微黃色(小心緩加，邊加邊搖)，然后加入鉬銻抗顯色劑5m1搖勻，定容至刻度?？瞻自囼?yàn)發(fā)酵液做相同的處理，在室溫20．25℃下放置4h左右，在721分光光度計(jì)上6

5、60nm處比色，測(cè)定吸光度，以空白試驗(yàn)發(fā)酵液為對(duì)照液調(diào)零點(diǎn)，讀取吸光度值，在工作曲線上查出磷標(biāo)準(zhǔn)液的濃度。方法2磷鉬藍(lán)比色法(1)磷鉬藍(lán)比色法原理在含磷的溶液中，加入鉬酸銨，在一定酸度條件下，溶液中的磷酸與鉬酸絡(luò)合形成黃色的磷鉬雜合酸一磷鉬黃。H3P04+12H2M004=H3[PMol2040]+12H20在適宜的試劑濃度下，加入適當(dāng)?shù)倪€原劑(sncl2或抗壞血酸)，使磷鉬酸中的一部分M06+還原為Mo5+，生成磷鉬藍(lán)(磷鉬雜多藍(lán))一H3P04·10Mn03·M0205或H3P04·8Mn03·2Mn20

6、5。在一定的范圍內(nèi)，藍(lán)色的深度與磷含量成形比，這是鉬藍(lán)比色法的基礎(chǔ)。用可見分光光度計(jì)在波長660nm處測(cè)定鉬藍(lán)的吸光值，以定量分析磷含量。(2)繪制OD660一磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液O、0.2、O.4、O．6、O．8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL(相當(dāng)于含磷O、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20υg)分別置于10mL具塞試管中，加入鉬藍(lán)比色混合液5mL，加水至刻度、混勻，于45℃水浴25min后，以O(shè)號(hào)管作空白，使用可見分光光度計(jì)在660nm波長處測(cè)定吸光

7、度，以測(cè)出的吸光度對(duì)磷含量繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)培養(yǎng)液中可溶性磷含量的測(cè)定接菌后分別在24、48、72、96、120小時(shí)取樣，將培養(yǎng)液4500r／min離心15min，準(zhǔn)確吸取5mL上清液置于10mL具塞試管中，加入5mL比色混合液，于45℃水浴25min，使用紫外分光光度計(jì)在660nm波長處測(cè)定吸光度，利用OD660磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)液中的磷含量。解有機(jī)磷的測(cè)定則是在上清液中加入過硫酸鉀溶液，120℃下反應(yīng)30min，然后重復(fù)以上過程。